论文摘要
背景:心室重塑包括心室生理性和病理性重塑,其中,病理性心室重塑是由一系列复杂的分子和细胞机制导致心肌结构、功能和表型的变化,包括心脏结构重塑、功能重塑和心肌电重塑。在形态学上,可表现为心肌肥厚,即:心肌肌重、心室容量的增加和心室形状的改变（模径增加→球状）以及心脏收缩和舒张功能的改变;在细胞水平表现为心肌细胞肥大、凋亡;胚胎基因和蛋白的再表达,心肌细胞外基质（ECM）量和组成的变化及心肌细胞间质的纤维化。心室重塑是一个非常复杂的过程,其确切的机制还不甚明了,有多种因素参与作用,包括:神经内分泌的激活、细胞因子的活化、细胞内信号传导通路的改变,基因表达的异常和多种基因之间的相互作用等等。calcineurin是一种受Ca2+/钙调素调节的丝氨酸-苏氨酸磷酸酶,被激活后可催化细胞质中的转录因子NFAT（T淋巴细胞激活核因子）脱磷酸化并向细胞核内转移,促进相关基因的转录表达。已有大量研究证实,该信号转导通路是参与调节心室病理性重塑的一条重要途径。无论是在肥厚型心肌病患者或肥厚型心肌病转基因动物模型的重塑心肌中,还是在高血压或心肌梗死所致的重塑心肌中,calcineurin及其下游通路的活化都起着极为重要的作用,干预或阻断该通路的活化可以延缓甚至逆转心肌病理性重塑的发生。Calsarcin是一组近年发现的肌小节蛋白,分为calsarcin-1、calsarcin-2、calsarcin-3三种亚型,其中仅有calsarcin-1表达于成体心肌细胞。Calsarcin-1（钙调神经酶相关肌小节蛋白Calcineurin associated sarcomericprotein-1）参与骨骼肌和心肌Z线蛋白的装配与稳定,Fery,N等采用酵母双杂交和免疫共沉淀和基因克隆等技术研究发现,包含开放读码框架（ORF）在内,Calsarcin-1 cDNA共含2422bp核苷酸,编码264个氨基酸。其中217～240位氨基酸序列对于固定钙调神经酶及对其活性调节是必须的。因此,calsarcin-1分子在calcineurin和心肌Z线之间架起了一座桥梁,将calcineurin和α-actinin固定于心肌细胞Z线附近。由于calcineurin是心肌病理性重塑过程中一个重要的分子,而它的活化和长期低浓度的钙离子信号刺激有关,因而calsarcin-1将calcineurin固定在Z线胞浆钙池附近与其活化有显著的生物学意义。另一方面,与Cabin1/cain或AKAP79等calcineurin活性负调节分子相比,calsarcin-1分子是心肌中calcineurin活性天然的负调节蛋白,它通过调控calcineurin信号通路,启动一系列的基因与蛋白表达,参与心肌重构、控制收缩和能量代谢等过程。研究证实,Calsarcin-1基因敲除小鼠心肌中calcineurin活性明显增高,其下游BNP、β-MyHC和MCIP分子表达明显上调;并且该基因敲除小鼠更易出现速发且显著的病理性心室重塑表现。这些研究结果均提示calsarcin-1可能是调节心肌细胞calcineurin活性进而调控心室重塑过程的一个重要分子,但由于目前对calsarcin-1的研究仍相对较少,其与心室重塑的关系及其在心室重塑过程中所起的作用仍不甚明了。在前期研究中,本学科梯队对2K,1C高血压模型大鼠进行研究发现,2K,1C大鼠心脏钙调神经酶活性明显升高,抑制其活性升高可以达到逆转大鼠心室重塑的效果。因此,在本研究中,我们对人心肌肌钙蛋白Ⅰ突变（cTnI R145W）转基因小鼠以及高血压致心肌肥厚大鼠模型的心室重塑情况进行研究并观察其心肌calasrcin-1表达调节及其相关calcineurin信号通路,并进一步探讨calasrcin-1/calcineurin信号通路异常与心室重塑的可能相关机制。目的:本研究首先采用双肾一夹方法成功制备高血压致心室重塑模型,并对之进行比较蛋白组学研究,以发现与病理性心室重塑特异相关的蛋白。并根据蛋白组学研究结果发现的calcineurin通路重要调节分子calsarcin-1分子,对本学科梯队构建的心肌肌钙蛋白Ⅰ突变位点cTnIR146W转基因小鼠进行进一步研究,探讨该基因突变引起HCM心室重塑过程中calcineurin/calsarcin-1相关信号通路的改变情况,并分离乳大鼠心肌细胞,采用离体模型对cTnI R146W突变引起心室重塑的分子细胞发病机制及其相关干预进行初步研究。内容与方法:1.分离并钳夹大鼠左肾动脉,采用双肾一夹（2K,1C）法制备病理性心肌肥厚模型,心脏彩色多普勒超声和病理HE和Masson染色评价模型大鼠心脏形态和功能变化以及心肌肥厚及纤维化程度。2.建立并优化大鼠心肌蛋白提取和纯化方法以及心肌二维电泳和质谱技术。3.提取假手术对照组和2K,1C模型组大鼠心肌蛋白,比较蛋白组学方法研究两组大鼠心肌差异表达蛋白,分类并探讨各组蛋白功能。4.Western和RT-PCR法验证蛋白组学方法发现的钙调神经酶（calcineurin）信号通路相关蛋白Calsarcin-1,并探讨calsarcin-1/calcineurin通路在病理性心肌肥厚调节中的作用。5.重组腺病毒腹腔注射方法建立携带野生型cTnⅠ和突变cTnⅠR146W的小鼠模型,并采用病理HE染色和心脏彩色多普勒超声方法鉴定。Western检测模型小鼠心肌calsarcin-1表达,并采用RT-PCR方法测定其下游通路β-MyHC分子的表达。6.RT-PCR和心脏彩色多普勒超声方法鉴定构建的cTnI R146W转基因小鼠的基因型和表型。7.Western和RT-PCR法检测cTnI R146W转基因小鼠心肌组织中Calsarcin-1的表达,并与转基因阴性小鼠作比较。测定转基因小鼠心肌组织calcineurin的活性及其表达,并采用ELISA法测定核NFATc1的量,探讨cTnI R146W转基因小鼠calsarcin-1/calcineurin通路的改变情况及其意义。8.克隆大鼠Calsarcin-1基因,并在其C末端引入增强型绿色荧光蛋白（EGFP）作为报告基因,构建包含Calsarcin-1基因的EGFP-N1真核载体（EGFP-N1-Cal）。脂质体介导转染HEK293细胞,荧光显微镜观察及western印迹法鉴定目的蛋白的表达。9.分离乳大鼠心肌细胞,培养分离的心肌细胞,重组EGFP-N1和EGFP-N1-Cal转染,荧光显微镜观察及western blot鉴定目的蛋白的表达。10.分离和培养乳大鼠心肌细胞,用本研究室构建成功的包含正常cTnI（620）和R146W突变基因的腺病毒载体（619）转染细胞,荧光显微镜观察EGFP表达并观测细胞形态、搏动率和细胞凋亡率。11.采用619/620和重组EGFP-N1-Cal共转染心肌细胞,检测重组EGFP-N1-Cal对619/620转染细胞的calsarcin-1/calcineurin通路调节情况。12.统计学方法:数据均测量数据以平均数加标准差（（?）±s）表示。组间差异采用独立样本t检验、单因素方差分析和x2检验（SPSS11.0）,P＜0.05有统计学意义。结果:1.经双肾一夹手术处理8周后,2K1C组大鼠收缩期血压明显高于假手术组分别为183±9和107±5mmHg（p＜0.01）。2K1C大鼠全心重（HW）/体重（BW）和左室重（LV）/体重（BW）明显高于假手术组大鼠（p＜0.05）。2.M型超声测量结果提示2K1C组大鼠左室舒末后壁厚度（LVPWd）和室间隔厚度（IVSd）轻度增加,而左室舒末内径（IVDd）则轻度变小（0.62±0.03 vs.0.65±0.02 cm p＜0.01）。心脏彩色多普勒超声检测发现,与假手术组相比,2K1C模型组大鼠心脏收缩功能无明显变化（由心肌收缩速度Sa和射血分数EF等来表示）。而表示舒张功能的指标E/A以及Ea/Aa则明显降低,而E/Ea在2K1C模型组则明显升高。病理HE染色提示大鼠左室心肌病理学检查光镜下见心肌细胞肥大、间质血管增生。而Masson染色提示2K1C组大鼠左室心肌出现明显的细胞间质纤维化。3.采用二维电泳结合质谱分析技术成功鉴定16个差异表达蛋白,其中包括能量代谢相关蛋白;细胞骨架相关蛋白;信号转导相关蛋白以及应激相关热休克蛋白。采用RT-PCR和Western技术证实蛋白组学发现Calcineurin调节相关蛋白Calsarcin-1的表达,两组心肌钙调神经酶活性测定提示双肾一夹模型大鼠心肌钙调神经酶活性高于假手术组,并且其活性高低与Calsarcin-1的表达存在负相关性。4.与正常对照组和携带正常cTn I重组蛋白小鼠相比,携带cTn IR146W重组蛋白小鼠超声形态和功能上未发现异常,而HE染色则发现该组小鼠心肌组织出现明显的细胞排列紊乱和间质细胞的增生。Western检测发现在携带突变cTnI蛋白的小鼠心肌中calsarcin-1表达明显降低,而其下游β-MyHC分子表达显著升高。5.心脏超声检测结果提示genotype（+）和genotype（-）组小鼠在形态结构上无明显改变,在心脏功能上表现为反映舒张功能的指标异常,提示genotype（+）组小鼠发生心室重塑。6.Western和RT-PCR检测显示在Genotype（+）组小鼠心肌中Calsarcin-1表达明显低于Genotype（-）组,见图。而Genotype（+）组小鼠心肌中Calsarcin-1/calcineurin下游β-MyHC表达高于Genotype（-）组,而两组小鼠心肌calcineurinβ亚单位表达则无明显差异。7.Genotype（+）组和Genotype（-）组小鼠心肌中Calcineurin活性分别为9.09±1.27和6.39±0.95 pmol Pi/mg protein/min（p＜0.01）。与该结果一致,在Genotype（+）组小鼠心肌中其核NFATc1结合活性明显高于Genotype（-）组小鼠,分别为0.21±0.03和0.13±0.01（p＜0.01）。8.成功克隆出小鼠心肌Calsarcin-1全长cDNA序列,并成功克隆至EGFP-N1载体中,测序证实与Genebank标准序列完全符合。9.脂质体介导重组EGFP-N1-Cal转染HEK293细胞,扩增、收集细胞,荧光显微镜观察及western印迹法均证实有目的蛋白表达。10.成功分离和培养乳大鼠心肌细胞,并将重组EGFP-N1-Cal、619和620腺病毒载体转染心肌细胞,48小时后荧光显微镜下观察到绿色荧光产生。收集细胞,提取心肌细胞蛋白用抗GFP单抗行westernblot分析,可见特异性重组蛋白条带。11.将重组EGFP-N1-Cal和619/620腺病毒载体共同转染心肌细胞,重组EGFP-N1-Cal+619转染心肌细胞组与单纯619组细胞相比,calcineurin活性明显降低,分别为（7.10±0.54vs.8.60±0.91 pmolPi/mg protein/min p＜0.05）,而且其核NFATc1结合活性也明显降低。结论与讨论:1.双肾一夹8周后大鼠出现明显的心室重塑过程,表现为心室的向心性肥厚、心肌细胞肥大、细胞间质纤维化和心室舒张功能障碍。2.二维电泳结合质谱分析技术可应用比较正常和重塑心肌差异蛋白谱。通过比较蛋白组学研究发现,能量代谢相关蛋白、细胞骨架相关蛋白、信号转导相关蛋白以及应激相关热休克蛋白等参与心室重塑过程。并通过Western和RT-PCR等技术证实Calsarcin-1/Calcineurin信号通路调节异常也是参与高血压所致心室重塑的重要因素。3.通过心脏超声等方法证实本研究梯队构建的转HCM致病基因心脏肌钙蛋白I突变（cTnI R146w）基因小鼠发生心室功能重塑,并通过进一步研究证实Calsarcin-1/Calcineurin信号通路调节异常也是参与cTnI R146W基因突变所致心室重塑的重要因素。4.重组Calsarcin-1与重组cTnI腺病毒共转染细胞后,重组Calsarcin-1可以纠正由cTnI R146W重组腺病毒所导致的Calsarcin-1/calcineurin信号通路的异常,重组Calsarcin-1能否缓解或逆转cTnI R146W所致的心室重塑有待在模型动物上进一步探讨。
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