蓝细菌PCC 7120裂合酶CpcT2编码固氮基因表达调控的研究

论文摘要

鱼腥藻PCC 7120是一种丝状蓝细菌,在培养基中缺失化合态氮源的条件下可分化形成异形胞执行固氮的功能。鱼腥藻PCC 7120的全基因组序列可从CyanoBase数据库中获得。T型裂合酶CpcT2（编码基因alr0647）和CpcT1（编码基因all5339）具有较高同源性,经实验室体外重组研究可知CpcT1可催化藻蓝色素PCB与半胱氨酸155位进行连接;而CpcT2无活性,即CpcT2无催化功能;但RT-PCR及western blot实验表明该基因在无氮情况下可以转录和翻译,从而通过进一步研究确定其为固氮基因。本研究的主要目的是通过对基因alr0647的定向敲除研究该基因的功能。本研究经分子生物学方法通过基因敲除对alr0647进行缺失失活,从鱼腥藻PCC 7120总DNA中调取alr0647基因片段,将基因片段缺失并替换为壮观霉素（Spectinomycin,简称Sp）抗性基因片段,按照三亲本杂交的方法将构建好的质粒转入鱼腥藻PCC 7120,利用抗性筛选得到同源重组成功的阳性转化子。由于蓝藻基因组含有多个拷贝,经分子生物学方法检测,证明得到的菌株为部分同源双交换的突变株。缺氮条件下从生长曲线等相关生理指标对突变株与野生株进行研究。结果表明,突变株的生长速度较野生株慢,但缺氮24小时后野生株和突变株均产生异形胞。由此可推测alr0647可能与生物固氮有关,但它的缺失并不会从根本上影响鱼腥藻PCC 7120的固氮功能。通过对alr0647的启动子分析,该基因前500bp可能没有完全包含alr0647的启动子序列,需对基因前的序列加长来进一步确定启动子的位置。对基因alr0647的定位分析,已知启动子PpetE与alr0647和gfp（克隆于穿梭载体pHB912）融合质粒的构建部分已经完成。PpetE是鱼腥藻PCC 7120中的一段序列,其已被证实可以启动蓝藻中的目的基因,通过将重组质粒转入鱼腥藻PCC 7120后,缺氮条件下观察绿色荧光的位置,可对alr0647进行定位,为alr0647的固氮功能提供理论依据。因此对于alr0647的定位及启动子分析有待进一步研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 固氮蓝藻PCC 7120 研究现状
• 1.1.1 质粒与载体
• 1.1.2 蓝藻外源基因的转化
• 1.1.3 基因克隆和基因图谱
• 1.1.4 蓝藻的诱变方法和突变株的分离
• 1.1.5 基因的表达调控
• 1.2 蓝细菌异型胞发育机制
• 1.2.1 异形胞简介
• 1.2.2 异形胞的形态特征
• 1.2.3 异形胞的功能
• 1.3 蓝藻报告基因
• 1.3.1 绿色荧光蛋白（GFP）在蓝藻中的研究现状
• 1.3.2 GFP 简介
• 1.3.3 基因表达与产物定位
• 1.3.4 GFP 荧光的检测
• 1.3.5 受铜离子诱导表达的启动子PpetE
• 1.4 本研究的目的与意义
• 第2章 材料与方法
• 2.1 本研究所用菌株与质粒
• 2.2 本研究所用质粒
• 2.3 培养基配方与试剂
• 2.3.1 培养基配制
• 2.3.2 抗生素在大肠杆菌和蓝细菌中的使用浓度
• 2.3.3 主要的分子生物学试剂
• 2.3.4 本研究所用引物
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 Anabaena PCC 7120 总DNA 的抽提
• 2.4.2 质粒DNA 的制备及其基因操作
• 2.4.3 体内定点诱变
• 2.4.4 转化
• 2.4.5 PCR 法鉴定
• 2.4.6 显微镜观察
• 第3章 alr0647 突变体的构建
• 3.1 引物设计
• 3.2 突变体的体外克隆及分析
• 3.3 鱼腥藻PCC 7120 对Sp 基础抗性的检测
• 3.4 体内突变体的筛选
• 3.5 突变体的表型分析
• 3.5.1 缺氮培养表型观察
• 3.5.2 异型胞变化
• 3.5.3 生理指标的测定
• 3.6 讨论
• 3.7 小结
• 第4章 alr0647启动子分析及定位
• 4.1 alr0647 的启动子分析
• 4.1.1 引物设计
• 4.1.2 穿梭质粒pHB912 的改造
• 4.1.3 启动子与报告基因gfp 融合载体的构建
• 4.1.4 启动子与报告基因gfp 融合载体的体内转化
• 4.1.5 alr0647的启动子分析
• 4.2 alr0647 定位的体外重组质粒的构建
• 4.2.1 引物设计
• 4.2.2 PpetE 与报告基因gfp 融合载体的构建
• 4.2.3 PpetE 连接alr0647 与报告基因gfp 融合载体的构建
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 第5章 集胞藻PCC 6803 中基因slr1212 的定向敲除
• 5.1 集胞藻pcc 6803 概述
• 5.2 引物设计
• 5.3 slr1212 的定向敲除
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录 攻读学位期间发表的论文