论文摘要
肺癌在男女常见恶性肿瘤死亡中均占首位,而且在世界范围内呈上升趋势。侵袭和转移是患者死亡的主要原因,大约90%的恶性肿瘤患者死于转移。目前已证实肿瘤转移是基因调控下的多阶段、多因素、多步骤过程,因此发现并证实与肿瘤转移过程高度相关的基因,可以更深入的了解肿瘤转移的机理,提供判断肿留患者预后、转移的分子标志物,找到治疗肿瘤的靶点,从而有效控制肿瘤转移。Ezrin蛋白为膜细胞骨架连接蛋白,近年来研究发现多种肿瘤都有Ezrin的突变和表达异常,Ezrin蛋白在肿瘤细胞转移过程中扮重要角色,但其在肺癌如何改变目前报道较少。本文首次通过对人体肺癌组织标本的研究以及体外、体内实验,较全面地对Ezrin在肺癌中的作用及机制进行探讨。目的:研究Ezrin蛋白在肺癌中的表达及其临床意义,并在此基础上探讨其在肺癌发生发展中可能的作用机制。方法:1、应用免疫组织化学技术检测75例肺癌手术标本Ezrin的表达,结合肺癌的临床病理特点进行分析。2、应用RT-PCR、Western blotting技术检测各种肺癌细胞系Ezrin表达,同时应用激光扫描共聚焦显微镜观察Ezrin的表达部位。分析Ezrin表达状况与肺癌细胞侵袭转移的关系,筛选出Ezrin表达最高与最低的Calu-3和A549细胞系。3、采用细胞增殖分析、划痕实验、Transwell等体外方法,比较Ezrin表达高低不同的Calu-3、A549细胞系的增殖能力、迁移能力以及粘附、侵袭能力。4、采用Ezrin表达高低不同的Calu-3、A549细胞系建立肿腺癌荷瘤裸鼠模型并鉴定,比较两种模型的肿瘤生长特点以及体内Ezrin表达状况。5、应用免疫组化方法检测人肺癌标本中Ezrin与pAKT的表达,并应用紫杉醇、LY294002药物进行体外、体内治疗,初步探讨Ezrin在肺癌中可能的作用机制。结果:1、肺癌组织中Ezrin的阳性表达率（77.3%）较正常肺组织（100%）降低（P＜0.05）。Ezrin表达下降与肺癌患者性别、年龄、肿瘤大小、病理类型、组织分化程度、临床分期等无关,与有无区域淋巴结及远处转移有关。另外,Ezrin表达在肺癌的发生、发展过程中有从胞膜向胞浆移位倾向。2、无论基因水平还是蛋白水平,遗传背景相同的3株肺巨细胞癌细胞系均有Ezrin表达。在低转移细胞系PG-LH7Ezrin表达最高,胞膜、胞浆均有表达,而在高转移细胞系BE1Ezrin表达最低,且只表达于胞浆;遗传背景不同的5株肺癌细胞系亦均表达Ezrin。A549肺腺癌细胞系表达最低且仅表达于胞浆,而Calu-3肺腺癌细胞系表达最高,胞膜、胞浆均有表达。3、低表达Ezrin的A549细胞系较之高表达Ezrin的Calu-3细胞系,增殖能力、迁移能力以及粘附、侵袭能力均增强。4、Calu-3、A549肺腺癌细胞在裸鼠体内接种成瘤率均为100%,经鉴定证实系人肺腺癌;移植瘤依然保持Ezrin高低表达不同的特性。Ezrin低表达的A549移植瘤较之Calu-3移植瘤成瘤时间早、生长速度快,但二者均未发现远处转移。5、pAKT蛋白在正常肺组织中全部阴性表达（0/16）,而在肺癌组织中阳性表达率为68.0%（51/75）,说明pAKT蛋白在肺癌组织表达显著高于正常肺组织（P＜0.01）,可能参与肺癌发生。pAKT蛋白表达水平与肺癌患者年龄、性别、吸烟、原发肿瘤大小、病理类型、有无区域淋巴结转移及远处转移等无关,与分化程度及肺癌分期有关。使用spearman相关分析显示Ezrin与pAKT表达无显著相关（r=-0.137,P=0.236）。体外实验表明LY294002对A549细胞系的IC50为29.2μM。应用IC20浓度药物3.4μM作用于A549细胞后,Ezrin表达不变（P＞0.05）,pAKT表达减少（P＜0.05）。体内实验表明,A549移植瘤治疗后,抑瘤率（IR%）均明显高于对照组（P＜0.05）,且紫杉醇联合LY294002组高于紫杉醇单剂治疗组（P＜0.05）。pAKT表达下降（P＜0.01）,而Ezrin表达未变。结论:1、Ezrin在肺癌组织,特别是有淋巴结转移的组织中表达下调,且存在Ezrin从胞膜到胞浆移位现象。Ezrin在肺癌的发生发展中可能发挥重要作用,有可能成为肿瘤治疗的良好靶点。2、遗传背景相同的肺癌细胞株Ezrin表达量随细胞系的侵袭转移潜能增加而相应降低。遗传背景不同的肺癌细胞株,低表达Ezrin者较高表达Ezrin者增殖能力、迁移能力以及粘附、侵袭能力均增强,提示Ezrin在肺癌发生发展中可能发挥抑癌基因的作用。3、通过对人肺癌标本及体外、体内实验研究表明,Ezrin可能间接通过pAKT路径或在pAKT上游发挥作用,也可能是通过pAKT以外路径参与肿瘤的生长。