发酵制备腺苷甲硫氨酸及其对凡纳滨对虾的应激保护

论文摘要

S-腺苷甲硫氨酸（s-adenosyl-L-methionine,简称SAM）,是一种存在于所有活细胞中的重要代谢中间体,在生物体的生理代谢中具有细胞膜保护功能和抗氧化作用。本文主要研究SAM高密度发酵培养工艺和检测方法,同时还研究了它对凡纳滨对虾的应激保护。结果如下:通过纸层析法、高效液相色谱检测法定性定量分析检测利用酿酒酵母发酵生产的SAM,得到发酵液中SAM的含量为0.35g/L.通过单因素实验对发酵工艺进行优化,得到最佳的发酵培养基为（g/l）:KH2PO4 2, ZnSO4·7H20 0.1, MgSO4·7H20 0.1 K2HPO4 1, （NH4）SO4 4,柠檬酸三钠5, MnSO40.3,CaC120.1,葡萄糖30,L-蛋氨酸3,酵母浸出物1。最佳发酵条件:pH=5.5,摇床转速为160r/min,温度为28℃,装液量为25ml/250ml,接种量为10%,经过优化SAM的发酵量由0.35g/L提高到0.904g/L。把由于捕捞和运输处于应激状态的凡纳滨对虾随机分为七组,一个为阴性对照组,三个实验组,三个阳性对照组。阴性对照组注射灭菌双蒸水,实验组分别注射浓度1mg/ml、0.5mg/ml、0.1mg/ml的SAM注射液,于30h小时内记录对虾数量并于5h,9h,12h,24h,30h时间点测定其免疫指标的变化。阳性对照组养殖两周,应激消失后,也分别注射浓度1mg/ml、0.5mg/ml、0.1mg/ml的SAM,记录并观察其存活数。结果如下,阴性对照组的死亡率最高,达到20%,阳性对照组没有死亡,死亡率为0。凡纳滨对虾死亡率:阴性对照组>实验组2>实验组1>实验组3>阳性对照组,结果显示注射SAM降低了应激凡纳滨对虾的死亡率。比较实验组与阴性对照组,凡纳滨对虾血淋巴中的NOS、PO、血蓝蛋白、血细胞数量等免疫指标都表现了显著差异（P<0.05）。阴性对照组血细胞数量呈下降趋势,且在每个采样时间点差异显著（P<0.05）。除5h之外,其余采样时间点阴性对照组血细胞数量与实验组差异显著（P<0.05）,并且均低于实验组。注射SAM以后,凡纳滨对虾血液中血细胞数量且呈先上升再下降的趋势,在12h时,数量达到峰值,且各组之间的差异显著（P<0.05）。注射SAM的实验组凡纳滨对虾,血蓝蛋白呈先上升再下降的趋势,在12h的时间点值最大,且各组之间差异显著（P<0.05）。阴性对照组血蓝蛋白呈上升趋势,在各个采样时间点差异显著（P<0.05）,且高于任何一个实验组,实验组之间差异也显著（P<0.05）。凡纳滨对虾注射SAM以后血液中NOS呈先上升后下降的趋势,每一个采样时间点实验组NOS都低于阴性对照组,且阴性对照组之间的差异都显著（P<0.05）,实验组2除9h外,与其他实验组差异显著（P<0.05）。阴性对照组的NOS呈上升的趋势,24h小时前每个采样时间点差异都显著（P<0.05）。注射SAM的凡纳滨对虾PO呈先上升再下降的趋势,在12h达到最高值（P<0.05）,且各组间差异最显著。阴性对照组的PO呈下降趋势,在各采样时间点差异显著（P<0.05）,且与各实验组之间差异也显著（P<0.05）,说明注射SAM显著影响凡纳滨对虾体内的PO值,即显著影响凡纳滨对虾的免疫指标,通过比较实验组和对照组的死亡率及各免疫指标变化趋势的不同,得出SAM可以抗捕捞和运输应激。把凡纳滨对虾（白斑病毒携带者）随机分为七组,养殖盐度为25,设一个阳性对照组,三个实验组,三个阴性对照组。实验组注射浓度为0.5mg/mLSAM,阴性对照组注射灭菌双蒸水,实验时将对虾从盐度为25海水中移到盐度为15,10,5的海水中,于72h内记录其死亡数并于10h,24h,36h,48h,72h时间点测定其免疫指标的变化,以此为依据判断SAM是否对凡纳滨对虾盐度应激有保护作用。阳性对照组注射浓度为0.5mg/mLSAM,不参加盐度应激实验,于72h内记录死亡数。结果如下,阴性对照组1的死亡率最高,达到50%,阳性对照组没有死亡,死亡率为0。对虾死亡率:阴性对照组1>阴性对照组2>阴性对照组3;实验组1>实验组2>实验组3;阴性对照组1>实验组1,阴性对照组2>实验组2,阴性对照组3>实验组3,SAM降低了凡纳滨对虾的死亡率。比较实验组和阴性对照组对虾血淋巴中的NOS、血蓝蛋白、PO值、血细胞数量等免疫指标,结果显示差异显著（P<0.05）。对照组凡纳滨对虾的血细胞数量明显低于实验组（P﹤0.05）,且呈下降趋势。实验组的血细胞数量0～10h呈上升趋势（P﹤0.05）,10～48h之间,血细胞数量逐渐下降的趋势,并且随着时间变化与同时间点的阴性对照组血细胞数量有显著性差异（P﹤0.05）,48h后,血细胞数量趋于稳定,且高于阴性对照组。阴性对照组的NOS值呈先升高后降低的趋势,12h达到最高,明显高于实验组,且与实验组的差异显著（P﹤0.05）,24～48h开始下降,48h后趋于稳定（P>0.05）,且明显低于实验前。实验组凡纳滨对虾血液的NOS值0～24h呈下降趋势,24～48h呈上升趋势, 48小时后NOS值趋于稳定,并且随着时间变化与同时间点的阴性对照组NOS值有显著性差异（P﹤0.05）。阴性对照组的血蓝蛋白含量在0～24h明显高于对应的实验组,36～72h均明显低于实验组。阴性对照组的血蓝蛋白含量0～10h先显著上升（P﹤0.05）,10h后持续下降,并且逐渐向实验前的含量靠近;实验组凡纳滨对虾的血蓝蛋白含量0～36h呈上升趋势（P﹤0.05）,36h后,血蓝蛋白有缓慢的下降趋势,并且随着时间变化与同时间点的对照组差异显著（P﹤0.05）。实验组凡纳滨对虾的PO值呈先上升后下降的趋势,在24h时达到峰值,且各实验组之间差异不显著（ P>0.05）。实验组的PO值在72h前大于实验前,72h时与实验前接近。阴性对照组凡纳滨对虾的PO值在0h～36h呈上升趋势,36h降到最低值,36h后PO值开始上升,72h时接近实验前。通过单因素方差分析可知,阴性对照组与实验组之间差异显著（P﹤0.05）,72h时实验组与对照组之间差异不显著,全部向实验前靠近。综合考虑死亡率和各免疫指标的变化得出SAM对凡纳滨对虾的应激有保护作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 文献综述
• 1.1 S-腺苷甲硫氨酸及其功能
• 1.1.1 SAM 的体内代谢
• 1.1.2 SAM 的制备方法
• 1.1.3 SAM 的定性和定量分析
• 1.1.4 腺苷甲硫氨酸的生理功能
• 1.2 对虾及其应激反应
• 1.2.1 虾类应激反应
• 1.2.2 对虾的抗应激研究
• 1.3 研究内容
• 1.4 研究线路
• 2 S-腺苷甲硫氨酸的发酵制备及检测
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 主要药品
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 主要培养基
• 2.1.5 主要试剂的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌种的培养及保存
• 2.2.2 纸层析法分析SAM
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 纸层析法定性分析SAM
• 2.3.2 高效液相法定量分析SAM
• 2.3.3 讨论
• 3 S-腺苷甲硫氨酸发酵工艺的优化
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 主要药品
• 3.1.3 仪器
• 3.1.4 主要培养基
• 3.2 方法
• 3.2.1 SAM 的分析检测方法
• 3.2.2 培养基的优化
• 3.2.3 培养条件的优化
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 发酵培养基的最佳碳源
• 3.3.2 发酵的最佳氮源
• 3.3.3 磷源的最佳浓度
• +的最佳浓度'>3.3.4 Na⁺的最佳浓度
• 3.3.5 蛋氨酸最适加入量
• 3.3.6 发酵最佳PH 值
• 3.3.7 最适装液量
• 3.3.8 最适接种量
• 3.3.9 发酵的最适温度
• 3.3.10 摇床转速的影响
• 3.3.11 讨论
• 4 S-腺苷甲硫氨酸对凡纳滨对虾捕捞和运输的应激保护
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 实验对象
• 4.1.2 材料与试剂
• 4.1.3 实验仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 实验条件
• 4.2.2 腺苷蛋氨酸注射浓度的确定
• 4.2.3 血液中各指标的测定
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 结果
• 4.3.2 讨论
• 5 S-腺苷甲硫氨酸对盐度变化下凡纳滨对虾的应激保护
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 实验对象
• 5.1.2 材料与试剂
• 5.1.3 实验仪器
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 实验对象
• 5.2.2 腺苷甲硫氨酸对凡纳滨对虾盐度应激的保护作用
• 5.2.3 血液中各指标的测定
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 结果
• 5.3.2 讨论
• 论文总结
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历
• 导师简介