水稻基因激活标签体系的建立及初步分析

论文摘要

随着水稻基因组全序列的测定完成,鉴定未知基因的功能已成为水稻功能基因组学研究的重点内容。功能基因组学研究最直接最有效的方法是构建饱和的基因突变群体,通过突变体分析鉴定基因功能。鉴于近年来根癌农杆菌介导的水稻遗传转化方法日趋成熟,利用转基因的方法获得突变体被认为是水稻功能基因组学研究的主要途径之一。本研究利用T-DNA插入突变技术创制水稻基因激活标签突变群体,并对该激活标签群体和以前创制的增强子捕获群体的再生植株的T-DNA侧翼序列一系列分析及激活标签系的RT-PCR分析,探讨了激活标签载体pER38在水稻功能基因组的研究中的重要作用。 本研究是中国高技术研究发展计划（863计划）项目“水稻突变体库的创制与功能基因组学研究”的一部分。主要取得了以下主要研究进展: 1.通过与合作者的共同努力,建立了高效、快速的大规模根癌农杆菌介导的水稻T-DNA插入突变遗传转化体系,从成熟胚诱导愈伤组织开始,约90d后即可得到转化植株。获得潮霉素抗性愈伤组织的效率超过90%,由抗性愈伤组织分化再生植株的效率超过80%,PCR和Southem杂交检测表明大约95%的潮霉素抗性植株含有T-DNA插入片段。提高转化效率的关键在于共培养温度从28-30℃降低至19-22℃,并在选择培养10-15d后及时选择继代培养4～12d。利用上述程序构建了大规模的水稻基因激活标签突变体库（约5万份）。 2.本人利用PCR walking和Tail-PCR技术对激活标签PER38和以前创建的增强子捕获标签pFX-E24.2-15R两个体系产生的再生植株T-DNA侧翼序列进行分离,分别获得172条和493条水稻水稻基因组侧翼序列。通过对两个体系的侧翼序列的分离效率;T-DNA的插入位点整合模式比较分析;T-DNA插入位点的分布分析以及激活标签系RT-PCR的分析,结果表明: （1）激活标签载体PER38获得的再生植株获得T-DNA的侧翼序列明显高于增强子捕获载体pFX-E24.2-15R,比例分别为63.2%和38.1%。 （2）通过侧翼序列的分析,两个载体的T-DNA在基因区的分布相似,在基因区分布频率较高,基因间隔区及重复区则较少;在染色体上分布与Genbank中报道的putative expressed和expressed的基因分布相近,而与hypothetical gene则明显不相关。 （3）通过激活标签系的RT-PCR的分析,与野生型比较,在检测的11个基因中有6个基因明显被激活表达,其T-DNA的插入位点在距离基因上游或下游1.1Kb-4Kb内,表明该载体的35S增强子确实起到激活基因表达的作用。 总之,目前创立了大约5万分T-DNA激活标签体系,对其再生株系研究表明,该标签突变群体具有激活标签突变体的一系列优点,是进行水稻功能基因研究的重要平台。

论文目录

• 第一章 前言
• 1.1 文献综述
• 1.1.1 水稻基因组学研究概述
• 1.1.2 人工诱变突变体库的构建及其利用
• 1.1.3 插入突变库的构建及其应用
• 1.1.4 T-DNA标签的原理与基因敲除
• 1.1.5 转座子标签技术基本原理及应用
• 1.1.6 插入突变技术的发展
• 1.1.7 水稻T-DNA插入突变技术研究进展
• 1.1.8 插入位点侧翼序列的分离
• 1.2 本研究的意义和技术路线
• 第二章 水稻基因激活标签体系的建立
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 水稻标签突变体库构建所用的载体
• 2.1.2 农杆菌菌株
• 2.1.3 水稻组织培养用相关培养基
• 2.1.4 根癌农杆菌细胞的制备
• 2.1.5 水稻愈伤组织诱导
• 2.1.6 水稻愈伤组织的转化
• 2.1.7 愈伤组织筛选和植株再生
• 2.1.8 激活标签载体再生植株的PCR和Southern杂交检测
• 2.2 结果分析
• 2.2.1 水稻遗传转化的效率及其影响因素
• 2.2.2 再生植株的PCR和Southern杂交检测
• 2.3 讨论
• 第三章 水稻基因激活标签体系的初步分析
• 3.1.T-DNA侧翼序列的分离及分析
• 3.1.1 材料与方法
• 3.1.2.结果分析
• 3.2 激活标签系统的RT-PCR的分析
• 3.2.1 材料与方法
• 3.2.2 结果分析
• 3.3 讨论
• 结论及创新点
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历