论文摘要
虽然体细胞核移植技术在牛的方面已经获得了很大成功,但是提高核移植效率,仍是该技术研究的长远任务。许多技术环节需要改进和完善,其中重组卵母细胞的卵——核融合在体细胞核移植技术中起着重要作用。在核移植中,融合率越高,可供培养的核移植胚胎数量越多,生产出的可用胚胎数就多,这样核移植效率也就越高。可见,重组胚的融合率直接影响着核移植的效率,是核移植技术成功的关键环节之一。试验采用延边黄牛耳皮肤成纤维细胞作供核细胞,MⅡ期去核卵母细胞作受体细胞,挤压法去核,卵周隙内注核,电融合的方法对融合液、融合方法以及适宜融合方法的融合条件进行研究,探寻适宜延边黄牛体细胞克隆的最佳融合条件。试验结果以融合率、卵裂率和重组胚体外发育率来评定,结果如下:1.0.25M、0.28M、0.30M不同浓度蔗糖融合液的融合率、卵裂率差异不显著;在4-8细胞胚胎发育率上0.28M组是最好的,显著高于0.25M组（51.01%vs 32.95%,p＜0.05）,与0.30M组差异不显著（40.12%,p＞0.05）。2.0.25M、0.28M、0.30M不同浓度D-山梨醇融合液的融合率、卵裂率差异不显著;在16细胞胚胎发育率上0.28M组与0.30M组差异不显著（20.68%,6 vs 17.45%,p＞0.05）,显著高于0.25M组（9.25%,p＜0.05）。3.0.25M、0.28M、0.30M不同浓度甘露醇融合液在融合率、卵裂率、4-8细胞胚胎发育率、16细胞胚胎发育率上,以0.28M组的效果最好,分别为89.54%,82.64%,61.29%,23.70%;但三组间的各项差异均不显著（p＞0.05）。4.0.28M蔗糖、D-山梨醇、甘露醇不同融合液对核移植效率的影响。三组的融合率差异不显著（88.44%vs 86.83%vs 86.85%,p＞0.05）;蔗糖与甘露醇融合液的卵裂率（87.98%vs86.06%）和囊胚发育率（22.16%vs 19.91%）差异不显著（p＞0.05）,但显著高于D-山梨醇融合液（78.64%和10.14%,p＜0.05）。5.0.28M蔗糖融合液,融合液浓度梯度融合法的融合率、卵裂率和囊胚发育率均显著高于普通融合法（92.98%vs 88.55%;91.07%vs 80.96%;40.06%vs 30.19%,p＜0.05）。6.0.28M甘露醇融合液,融合液浓度梯度融合法的融合率、卵裂率和囊胚发育率均显著高于普通融合法（91.22%vs 84.89%;88.02%vs 80.42%;39.51%vs 29.19%,p＜0.05）。7.使用1200v/cm融合电场强度的融合率为89.07%与1100v/cm和1300v/cm的87.66%和90.14%差异不显著（p＞0.05）,与1000v/cm的81.83%存在显著差异（p＜0.05）;在卵裂率上1100v/cm和1200v/cm显著高于1300v/cm（85.07%vs 86.47%vs 76.96%,p＜0.05）,与1000v/cm差异不显著（80.85%,p＞0.05）;囊胚发育率以1200v/cm的29.59%最高,与1100v/cm的28.89%不存在差异（p＞0.05）,但显著高于1000v/cm和1300v/cm的19.46%和14.61%（p＜0.05）。8.使用2次融合脉冲的融合率、卵裂率和囊胚发育率分别为88.03%,86.35%和31.63%,是适宜延边黄牛体细胞克隆、融合液浓度梯度融合法的最佳脉冲次数。9.脉冲时程为40μs的融合率与20μs、80μs差异不显著（86.10%vs 83.30%vs 84.60%,p＞0.05）,显著高于10μs（79.60%,p＜0.05）;20μs,40μs的卵裂率（88.54%,83.61%vs 74.21%,65.63%,p＞0.05）和囊胚发育率（32.92%vs 30.38%vs 20.88%vs 19.62%,p＞0.05）显著高于10μs、80μs。结论:适宜延边黄牛体细胞克隆的融合液为0.28M蔗糖融合液。融合液浓度梯度融合法能有效提高延边黄牛体细胞克隆效率。适宜延边黄牛体细胞克隆、融合液浓度梯度融合法的融合电场强度为1200v/cm;融合脉冲次数为2次;融合脉冲时程为40μs。