论文摘要
脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）是一种常染色体隐性遗传的神经肌肉疾病，其致病基因为运动神经元生存（surrival motor neuron，SMN）基因，编码SMN蛋白。该基因缺失后，造成全长SMN（full-length surrival motor neuron，fl-SMN）蛋白缺乏。组蛋白脱乙酰酶抑制剂丙戊酸（valproic acid，VPA）能激活基因的转录，促进SMN的表达和转录。脊髓前角α运动神经元的变性、坏死，是SMA的主要病理改变，凋亡在神经细胞死亡中起重要作用。Caspase-3处于凋亡线性过程的下游，最终导致DNA的切割。SMN基因的转染、锌指蛋白A20均能减少Caspase-3的活化与表达，从而抑制细胞凋亡。目的：观察A20、SMN、Caspase-3mRNA的表达及与细胞凋亡的关系，以探讨A20与SMA细胞凋亡的关系，从而进一步探讨SMA的发病机制，为寻求SMA的治疗奠定实验基础。方法：1采用密度梯度离心法对原代骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSCs）进行分离、纯化及培养，并用免疫荧光法对CD34、CD44抗体进行鉴定。2用β-巯基乙醇、二甲基亚矾、丁羟茴醚将MSCs定向分化为神经元样细胞（neuron-like cells，NLCs），并通过细胞形态学改变及神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、神经丝蛋白（neurofilament，NF）的免疫荧光检测进行鉴定。3绘制细胞生长曲线，观察细胞增殖变化。4 TUNEL荧光染色观察细胞凋亡。5 RT-PCR检测比较各组细胞A20，SMN及Caspase3mRNA的表达。6免疫荧光共聚焦观察A20，f1-SMN及Caspase-3蛋白的共定位情况。结果：1鉴定MSCs后显示CD34为阴性，CD44为阳性，证实为MSCs。2诱导5小时后，大多数细胞转变为类似于神经元的形态，有长的突起，相互之间连接呈网状。NSE、NF表达均为阳性，证实为NLCs。3各组细胞均经过了两次负增殖过程，在第2次负增殖中，SMA细胞的负增殖较对照组NLCs增加（P＜0.05），VPA干预后负增殖减小（P＜0.05）。4 SMA细胞凋亡率较对照组NLCs明显增高（P＜0.05）；VPA干预后SMA细胞凋亡率降低（P＜0.05），对照组NLCs凋亡率增加（P＜0.05）。5 SMA细胞的A20、f1-SMNmRNA表达低于对照组NLCs（P＜0.05），缺乏外显子7编码的运动神经元生存（surrival motor neuron-delete exon 7，△7-SMN）基因及Caspase-3mRNA的表达高neuron-delete exon 7，△7-SMN)基因及Caspase-3mRNA的表达高于对照组NLCs（P＜0.05）。VPA干预后，SMA细胞中A20、f1-SMNmRNA的表达增加（P＜0.05），Caspase-3mRNA的表达减少（P＜0.05），△7-SMNmRNA的表达增加（P＞0.05）；对照组NLCsA20mRNA的表达减少，f1-SMN、△7-SMN mRNA的表达增加（P＞0.05），Caspase-3mRNA的表达增加（P＜0.05）。随着干预SMA细胞的VPA浓度增加，其A20、f1-SMN和A7-SMN mRNA表达增加，Caspase-3mRNA的表达先减少后增加。6 A20蛋白与f1-SMN蛋白、A20蛋白与Caspase-3蛋白均无共定位关系。结论：1 A20在SMA中有抗细胞凋亡作用，A20与f1-SMN及Caspase-3蛋白之间可能无直接相互作用。2 A20mRNA表达的增加可能是VPA抗SMA细胞凋亡的机制之一。