人类基因C4orf13、CDK5RAP1_v3、CDK5RAP1_v4和PXK的克隆和功能研究

论文题目: 人类基因C4orf13、CDK5RAP1_v3、CDK5RAP1_v4和PXK的克隆和功能研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 微生物学

作者: 邹先琼

导师: 毛裕民,邱冠周

关键词: 基因克隆,功能研究

文献来源: 中南大学

发表年度: 2005

论文摘要: 从大规模的胎脑组织cDNA克隆和测序计划中,我们通过生物信息学分析选取了4条全长cDNA进行进一步的研究,以探讨这些基因的功能及其与人类疾病的关系。 分离到的人类新基因C40rf13 cDNA全长2706bp,编码一个340氨基酸的多肽,其含有一个典型的SBF结构域(SBF,Sodium Bile acid cotransporter family)和十个可能的跨膜区段。假定的蛋白C40rf13显示了与在大鼠和非洲爪蟾中同源蛋白高度的相似性。人类基因C40rf13定位于染色体4q31.2并含有12个外显子。RT-PCR结果表明人类基因C40rf13在成人组织中广谱表达,其中在肝脏和肺组织中的表达水平相对较高,在胎盘、肾脏、脾脏和胸腺组织中的表达水平居中,在心脏、前列腺和睾丸组织中的表达水平较低。表达谱芯片结果显示人类新基因C40rf13在胃癌组织中表达显著上调。 两个人类基因CDK5RAP1新的剪切体,CDK5RAP1_v3和CDK5RAP1_v4被成功地从胎脑文库中克隆出来。CDK5RAP1_v3和CDK5RAP1_v4的cDNA分别长1923bp和1792bp。序列分析表明CDK5RAP1_v4相对CDK5RAP1_v3缺少了一个外显子,这导致这两种cDNA编码不同的蛋白。推断的蛋白分别含有574个氨基酸(CDK5RAP1_v3)和426个氨基酸(CDK5RAP1_v4),它们具有共同的N-端420个氨基酸残基。RT-PCR分析的结果显示人类CDK5RAP1_v3广泛地在成人组织中表达。CDK5RAP1_v3表达水平在胎盘和肺组织中相对较高,而在心脏、大脑、肝脏、骨骼肌、胰脏、脾脏、胸腺、小肠和外周血淋巴组织中表达水平较低。相对来说,CDK5RAP1_v3主要在大脑、胎盘和睾丸组织中表达。 PX(Phox homology)结构域特异性地与磷脂酰肌醇脂质结合,这一结合对于它们的细胞功能是关键的。一条全长的人类PXK基因(human PX domain containing serine/threonine kinase gene)cDNA以前曾经被克隆出来,我们将其命名为PXK_v1。PXK_v1含有一个S_TKc结构域(serine/threonine kinases, catalytic domain),但是缺少了几个对于催化活性绝对必要的几个氨基酸残基。目前的研究表明在人类胎脑组织中至少存在人类PXK基因四种其它的不同剪切体,我们将其分别命名为PXK_v2,PXK_v3,PXK_v4及PXK_v5。RT-PCR结果显示了人类PXK_v1,PXK_v2及PXK_v4转录本在成人组织中除了心脏之外广泛表达。相对地,PXK_v3转录本仅仅在外周血淋巴组织中低水平表达而PXK_v5转录本不能被检测到。我们将PXK_v1或PXK_v2基因的读框克隆入pET32a载体,在大肠杆菌Rosette(DE3)菌株中获得表达后我们纯化了蛋

论文目录:

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专业名词缩写中英文简表

第一章 前言

1.1 胆汁酸钠协同转运蛋白家族研究概述

1.2 CDK5RAP1蛋白概述

1.3 激酶概述

1.4 假激酶概述

第二章 材料和方法

2.1 材料与试剂

2.1.1 材料

2.1.2 试剂盒，酶类，常用试剂

2.1.3 菌株、质粒和细胞株

2.1.4 主要仪器设备

2.1.5 常用试剂配制

2.1.6 计算机软件及数据库

2.1.7 引物

2.2 方法

2.2.1 cDNA文库的构建、测序以及生物信息学初步分析

2.2.2 MTC Panel表达谱分析

2.2.3 蛋白的原核表达和纯化

2.2.4 蛋白激酶活性测定

2.2.5 真核细胞的培养和转染

2.2.6 亚细胞定位

2.2.7 细胞周期影响的测定

2.2.8 细胞凋亡影响的测定

2.2.9 酵母双杂交系统筛选与PXK_v1或PXK_v2蛋白相作用的蛋白

2.2.10 荧光共定位

2.2.11 免疫共沉淀

2.2.12 基因芯片杂交与分析

第三章 实验结果和讨论

3.1 人类基因C40rf13的克隆和表达谱研究

3.1.1 cDNA的克隆及序列的生物信息学分析

3.1.2 C4orf13基因的染色体定位和该位点的疾病基因

3.1.3 C4orf13基因的表达谱分析

3.1.4 SAGE分析

3.1.5 C4orf13基因的表达谱芯片分析

3.2 人类基因CDK5RAP1_v3和CDK5RAP1_v4的克隆和表达谱研究

3.2.1 cDNA的克隆及序列的生物信息学分析

3.2.2 CDK5RAP1基因的染色体定位及该位点的疾病基因

3.2.3 CDK5RAP1_v3及CDK5RAP1_v4的表达谱分析

3.3 人类基因PXK的克隆和功能研究

3.3.1 cDNA的克隆及序列的生物信息学分析

3.3.2 PXK基因的表达谱分析

3.3.3 PXK_v1及PXK_v2蛋白的原核表达

3.3.4 蛋白激酶活性的测定

3.3.5 五种PXK蛋白异构体及PXK_v1三个突变体的亚细胞定位

3.3.6 PXK五种剪切体在COS7细胞中过表达对细胞周期和凋亡的影响

3.3.7 酵母双杂交系统筛选与PXK_v1或PXK_v2蛋白相互作用的蛋白

3.3.8 PPP1R7基因的序列特征和亚细胞定位

3.3.9 PPP1R7蛋白与PXK蛋白相互作用的验证

第四章 小结

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表论文目录

发布时间: 2006-03-28

参考文献

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