表面纤溶系统的机理研究及其在冠脉支架表面的构建

论文摘要

近年来,血液接触材料在心血管疾病的临床治疗中得到了飞速的发展。但其作为异体材料,植入人体时所引起的血栓问题至今仍未得到妥善解决。大量研究证实,任何一种异体材料在与血液相接触时都会不可避免的引起凝血反应。因此,一些研究者试图通过合理的设计在材料表面模拟人体纤溶系统,赋予材料溶解初级血栓凝块的能力。表面纤溶系统的构建为实现真正意义上的抗血栓材料提供了一种全新的思路。构建表面纤溶系统的关键在于使材料能够从血液中选择性结合纤溶系统核心蛋白质——血纤维蛋白溶酶原（Plg）及其激活剂（如组织型纤溶酶原激活剂（t-PA））,通过二者之间的相互作用产生具有降解纤维蛋白活性的纤维蛋白溶酶,实现对初生血栓的溶解。目前,人们普遍认为ε-氨基和羧基自由的赖氨酸（ε-赖氨酸）对Plg及t-PA具有特异性亲和力,因此,ε-赖氨酸在材料表面的固定将有可能实现表面纤溶系统的构建。基于上述分析,本论文的主要工作是将ε-赖氨酸引入到材料表面,实现表面纤溶系统的构建,并试图从蛋白质水平阐述其作用机理。在此基础上,将ε-赖氨酸化表面的概念应用到冠脉支架上,实现表面纤溶系统在心血管植入材料表面的构建。具体研究内容如下：首先制备了ε-赖氨酸和α-赖氨酸（α-氨基和羧基自由的赖氨酸）修饰的模型金表面,并系统研究了二者与Plg之间的相互作用。采用自组装二肽分子Cys-α-NH2-Lys（CK1）和Cys-ε-NH2-Lys（CK2）的方式实现了ε-赖氨酸和α-赖氨酸在模型金表面的固定。利用水接触角和椭偏厚度测试对改性表面的性质进行表征。通过酶联免疫吸附法（ELISA）比较血浆中的Plg在两种赖氨酸化表面的吸附情况,证实ε-赖氨酸确实能够实现对Plg的选择性结合。通过表面等离子体共振仪（SPR）考察了不同浓度的Plg在两种赖氨酸化表面的动态结合过程。结果表明：ε-赖氨酸化表面对Plg具有更高的结合速率常数和更低的解离速率常数,其亲和常数接近于α-赖氨酸化表面的15倍,从结合动力学的角度进一步证实ε-赖氨酸对Plg具有更高的特异性亲和力。利用纤维蛋白溶酶活性测试,证明该ε-赖氨酸化表面结合的Plg具有更高的纤溶酶转化活性。该研究通过最简单的表面设计,证实了ε-赖氨酸是实现纤溶表面的关键结构,为后续纤溶功能材料的制备提供了理论依据。接下来将对Plg具有特异性亲和力的ε-赖氨酸固定在冠脉支架表面,实现表面纤溶系统在心血管植入材料表面的构建,并对其血液相容性进行了系统研究。采用表面引发原子转移自由基聚合法在L605钻铬合金支架表面聚合甲基丙烯酸2-羟乙酯（HEMA）,并将ε-赖氨酸共价接枝在poly（HEMA）内侧链末端。通过X射线光电子能谱测试证实整个改性过程的成功性。同位素标记的纤维蛋白原及白蛋白吸附测试表明poly（HEMA）修饰的L605表而具有极好地排斥非特异性蛋白质吸附的能力,问接法ELISA测试表明poly（HEMA）-Lys修饰的L605表而能够从血浆中选择性结合纤溶酶原。血浆复钙化测试证明该赖氨酸化表面结合的Pig经t-PA激活后能够有效地溶解血浆中的纤维蛋白凝块,而且该纤溶能力具有一定的稳定性和可再生性,即能通过Plg在表面的动态交换保持其活性,进而实现对初生血栓的多次溶解。本研究为解决支架内血栓问题提供了一种的新的思路,同时也为纤溶表面的临床应用奠定了重要的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 抗凝血材料的研究进展
• 1.1.1 凝血机理
• 1.1.2 血液与材料表面的相互作用
• 1.1.3 抗凝血材料研究进展
• 1.1.3.1 生物惰性表面
• 1.1.3.2 生物活性表面
• 1.2 纤溶功能材料的研究进展
• 1.2.1 纤溶系统
• 1.2.1.1 纤溶系统的构成
• 1.2.1.2 纤溶系统作用机理
• 1.2.2 表面纤溶系统的构建
• 1.3 研究目的及内容
• 第2章 基于SPR研究赖氨酸化表面与纤维蛋白溶酶原之间的相互作用
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 材料与试剂
• 2.2.2 实验仪器
• 2.2.3 两种赖氨酸化表面的制备
• 2.2.3.1 金片表面清洗过程
• 2.2.3.2 金片表面自组装CK1和CK2分子
• 2.2.4 水接触角测试
• 2.2.5 血浆中纤维蛋白溶酶原吸附测试（ELISA）
• 2.2.6 血纤维蛋白溶酶活性测试
• 2.2.7 表面等离子共振技术研究两种赖氨酸化表面对纤维蛋白溶酶原的亲和力
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 ε-赖氨酸和α-赖氨酸修饰的金表面的制备
• 2.3.2 ε-赖氨酸和α-赖氨酸修饰的金表面的表征
• 2.3.2.1 水接触角测试
• 2.3.3 浆中纤维蛋白溶酶原吸附测试（ELISA）
• 2.3.4 血纤维蛋白溶酶原活性测试
• 2.3.5 表面等离子共振技术研究两种赖氨酸化表面对纤维蛋白溶酶原的亲和力
• 2.4 本章小结
• 第3章 具有纤溶功能的冠脉支架的制备及其血液相容性研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 材料与试剂
• 3.2.2 实验仪器
• 3.2.3 L605-poly（HEMA）-lysine表面的制备
• 3.2.3.1 L605钴-铬合金支架表面的羟基化
• 3.2.3.2 L605钴-铬合金支架表面的氨基化
• 3.2.3.3 L605钴-铬合金支架表面引发剂的固定
• 3.2.3.4 HEMA在L605钴-铬合金支架表面的ATRP反应
• 3.2.3.5 L605钴-铬合金支架表面接枝ε-赖氨酸
• 3.2.4 X射线光电子能谱测试（XPS）
• 3.2.5 非特异性蛋白质吸附测试
• 3.2.5.1 相关蛋白质溶液的配制
• 3.2.5.2 蛋白质的同位素标记
• 3.2.5.3 游离碘含量的测定
• 3.2.5.4 蛋白质吸附测试
• 3.2.6 血纤维蛋白溶酶原吸附测试（ELISA）
• 3.2.7 血栓溶解性能测试
• 3.2.8 赖氨酸化L605钴-铬合金支架表面稳定性的测试
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 L605-poly（HEMA）-lysine钴-铬合金支架表面的制备和表征
• 3.3.1.1 L605-poly（HEMA）-Lysine表面的制备
• 3.3.1.2 表面化学表征
• 3.3.2 非特异性蛋白质吸附测试
• 3.3.3 血纤维蛋白溶酶原吸附测试（ELISA）
• 3.3.4 血栓溶解性能测试
• 3.3.5 赖氨酸化L605钴-铬合金支架表面稳定性的测试
• 3.4 本章小结
• 第4章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 科研成果目录