芜菁胚发育相关基因BcNAC2的功能分析

论文摘要

花的发育是植物发育过程中最引人注目的事件,花芽的形成意味生殖生长的开始（卢海宇等,2009）. Coen和Meyerowitz （1991）提出了花器官发育的ABC模型,这是植物发育分子生物学研究领域里程碑式的重大突破,也为人们打开了一扇通向花器官多样性研究的大门。在芸薹属作物中,雄性不育现象普遍存在,并且应用芸薹属作物的雄性不育性,利用杂种优势,提高产量,但雌性不育现象在芸薹属作物中却鲜有报道。本研究以芜菁（Brassica campestris L. ssp. rapifera （Matzg） Sinsk, syn. B. rapa L.）雌蕊退化突变体tpa（turnip pistil abortion）及其野生型（可育株）雌蕊和胚发育转录组分析中发现的基因BcNAC2为研究对象,通过PCR扩增方法对芜菁BcNAC2的cDNA全长和DNA全长进行了分离、鉴定及蛋白质结构和功能的预测；从NCBI上搜索到相关的NAC蛋白进行同源比对,在此基础上构建分子进化树；采用半定量RT-PCR （Reverse transcriptase polymerase chain reaction）技术分析该基因在芜菁不同发育阶段的营养组织与生殖组织中的表达状况；通过组织原位杂交的方法检测授粉受精后该基因的表达部位；构建了芜菁反义BcNAC2的植物表达载体,用中国白菜的变种菜心（Brassica campestris L. ssp.chinensis var. utilis Tsen et Lee）为材料进行遗传转化,通过遗传转化获得转基因植株,从分子生物学方面对转基因植株进行检测和分析。研究结果如下：（1）在已有的cDNA-AFLP差异片段的基础上,采用同源序列克隆技术获得与雌蕊发育相关的芜菁NAC转录因子——BcNAC2的cDNA和DNA序列全长。序列分析表明,BcNAC2的cDNA序列全长为2080 bp,最大ORF框为1683 bp,编码560个氨基酸序列。其DNA序列全长中包含6个外显子和5个内含子,外显子-内含子交接处序列遵循GT-AG的普遍规律,属于的剪接体识别序列。其中内含子的长度依次为67 bp、102 bp、269bp、81 bp和83 bp。对推导的氨基酸序列分析发现,该序列第9-159个氨基酸编码NAC结构域。利用SMART数据库进一步分析发现,其为NAM亚家族蛋白。BcNAC2的二级结构包含19.64%的α-螺旋,15.00%的p-折叠和65.36%的无规则卷曲结构,三级结构呈马鞍形。此外,与拟南芥的NAC2蛋白的功能结构域中的motif进行比较发现,芜菁BcNAC2与拟南芥AtNAC2功能结构域内的特征序列有显著的差异,主要区别在磷酸化位点上。在芜菁BcNAC2蛋白的NAC结构域内,发现有2个N-糖基化位点（79-82,103-106氨基酸）,4个蛋白激酶C磷酸化位点（83～85,87-89,95-97,110-112氨基酸）,5个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点（18～21,42～45,71-74,95-98,137～140氨基酸）,2个N-酰基化位点（80～85,109-114氨基酸）。而在拟南芥NAC2蛋白的结构域中共发现有2个N-糖基化位点（57-60,79-82氨基酸）,1个环腺苷酸和鸟苷酸依赖的蛋白磷酸化激酶（53～56氨基酸）,3个蛋白激酶C磷酸化位点（42-44,61-63,72～74氨基酸）,3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点（30-33,37-40,72～75氨基酸）,2个酪氨酸激酶磷酸化位点（11～17,11～18氨基酸）,3个N-酰基化位点（4-9,58～63,85～90氨基酸）。由此可知,芜菁BcNAC2蛋白和拟南芥NAC2蛋白结构域内的特征序列差异较为明显,序列的差异是否会导致基因功能的不同,还需要后续进一步的研究。（2）从NCBI上搜索下载相关的30个NAC蛋白与芜菁BcNAC2进行同源比对,构建了分子进化树。结果表明,BcNAC2与拟南芥的AtNAC2、烟草的TERN和大豆的GmNAC6的亲缘关系较近,可以归为一类,均属于NAM亚家族。其中BcNAC2与AtNAC2的亲缘关系更近,说明同科植物的亲缘关系较近。通过对NAM亚家族的蛋白进行序列比对发现,在N端的NAC保守结构域处相似性较高,而在C端序列呈现多样性,同源性较低,表明不同的NAC转录因子可能通过不同的C-端序列调控转录活性,符合NAC转录因子的结构特点。（3）采用半定量RT-PCR分析和组织原位杂交等两种方法分析BcNAC2的表达特性。半定量RT-PCR分析了芜菁BcNAC2在芜菁不同发育阶段中的表达动态,发现该基因有组成型表达特点,其中在小蕾、中蕾中的表达量较高,而在授粉受精后的嫩角果中,授粉后8天的嫩角果表达量最高。该基因不仅在前期营养器官中能正常表达,而且在后期的种子或胚的形成过程中也有较高丰度的表达,暗示该基因在植物整个生长发育过程中都可能发挥着重要的作用。组织原位杂交分析结果表明,BcNAC2在授粉后4天胚珠的胚囊部位有较高的表达,而授粉8天的胚珠内部也有较高丰度的表达,上述结果与半定量的分析结果基本一致,由此推测,BcNAC2参与了种子或胚的发育形成过程。（4）在正确分离反义BcNAC2片段的基础上,构建了含有组成型启动子CaMV35S的反义RNA植物表达载体pBI35s-BcNAC2,并通过“冻融法”将其导入农杆菌,根据已建立的高效菜心遗传转化体系,利用农杆菌介导的方法将反义BcNAC2表达载体导入菜心中,目前已成功获得了6株KanR芽系,正对其可能的生物学功能进行进一步的研究。

论文目录

• 致谢
• 缩写词
• 氨基酸简写符号
• 摘要
• Abstract
• 0 引言
• 1 文献综述
• 1.1 植物雌蕊发育的分子遗传研究进展
• 1.1.1 雌配子体的发育
• 1.1.1.1 大孢子囊及大孢子的发生
• 1.1.1.2 雌配子体的形成
• 1.1.2 植物雌蕊发育分子遗传机制的研究
• 1.1.2.1 花器官发育的ABCDE模型
• 1.1.2.2 心皮的个体发生学说
• 1.1.3 与植物雌蕊发育相关的基因
• 1.1.3.1 NAC2
• 1.1.3.2 KNOX
• 1.1.3.3 WUS
• 1.1.3.4 CLAVATA
• 1.1.3.5 MGO
• 1.1.3.6 CRC
• 1.1.3.7 ScPIP2a
• 1.1.4 植物雌蕊发生的基因网络
• 1.2 植物胚珠发育
• 1.2.1 胚珠的发育
• 1.2.2 胚珠特征基因
• 1.2.3 珠被发育相关基因
• 1.2.4 胚囊发育相关基因
• 1.2.5 胚珠发育模式
• 1.3 NAC转录因子的研究进展
• 1.3.1 与植物生长及发育相关的NAC
• 1.3.1.1 参与顶端分生组织发生及花器官发育
• 1.3.1.2 参与植物器官的衰老
• 1.3.1.3 参与侧根的形成
• 1.3.1.4 参与次生壁的增厚
• 1.3.1.5 参与细胞周期的调控
• 1.3.2 与胁迫响应相关的NAC
• 1.3.2.1 参与生物胁迫反应
• 1.3.2.2 参与非生物胁迫反应
• 1.3.3 miRNAs调控NAC的表达
• 1.3.4 NAC转录因子蛋白水平的调控
• 2 芜菁BcNAC2的分离及其序列分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料与主要试剂
• 2.1.2 植物基因组DNA的提取
• 2.1.3 植物总RNA的提取
• 2.1.3.1 植物总RNA的提取
• 2.1.3.2 总RNA的检测
• 2.1.4 cDNA的合成
• 2.1.4.1 采用Clonetech公司试剂盒方法合成cDNA
• 2.1.4.2 采用TaKaRa试剂盒的方法合成cDNA一链
• 2.1.5 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.1.5.1 大肠杆菌DH 5α感受态细胞的制备
• 2.1.5.2 大肠杆菌TG1感受态细胞的制备
• 2.1.6 LB培养基的配制
• 2.1.7 cDNA和DNA测序
• 2.1.8 BcNAC2基因cDNA序列全长的扩增
• 2.1.8.1 cDNA编码区的获得
• 2.1.8.2 cDNA非编码区的获得
• 2.1.9 BcNAC2基因DNA序列全长的扩增
• 2.1.10 芜菁BcNAC2全长序列的特征分析
• 2.1.11 芜菁BcNAC2蛋白结构域与拟南芥NAC2蛋白结构域的比较
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 总RNA的提取与cDNA的合成
• 2.2.2 BcNAC2 cDNA全长的获得
• 2.2.3 BcNAC2 DNA全长的获得
• 2.2.4 BcNAC2核苷酸序列分析
• 2.2.5 NAC基因同源比对及进化树分析
• 2.2.6 BcNAC2与AtNAC2结构域的比较
• 2.3 讨论
• 2.3.1 芜菁BcNAC2全长序列的结构特征分析
• 2.3.2 芜菁BcNAC2的功能预测
• 3 芜菁BcNAC2基因的表达分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 半定量RT-PCR分析的实验材料与方法
• 3.1.1.1 半定量RT-PCR的实验材料
• 3.1.1.2 半定量RT-PCR的引物设计
• 3.1.1.3 半定量RT-PCR的体系及程序
• 3.1.2 组织原位杂交分析的实验材料与方法
• 3.1.2.1 实验材料
• 3.1.2.2 试剂及溶液配制
• 3.1.2.3 材料固定、包埋和制片
• 3.1.2.4 地高辛标记RNA探针
• 3.1.2.5 原位杂交步骤
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 RT-PCR分析
• 3.2.2 组织原位杂交分析
• 3.3 讨论
• 3.3.1 RT-PCR分析BcNAC2在胚或种子发育中起作用
• 3.3.2 组织原位杂交分析BcNAC2在胚珠发育过程中起作用
• 4 芜菁BcNAC2的反义载体构建及对菜心的遗传转化
• 4.1 芜菁BcNAC2的反义载体构建
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 反义片段的获得
• 4.1.3 质粒的提取
• 4.1.4 芜菁BcNAC2反义表达载体的构建
• 4.1.4.1 反义片段及pBI121的制备
• 4.1.4.2 表达质粒的构建
• 4.1.5 农杆菌感受态的制备及转化
• 4.1.5.1 农杆菌感受态的制备
• 4.1.5.2 冻融法转化农杆菌
• 4.1.5.3 农杆菌中质粒鉴定
• 4.2 反义表达载体对菜心的遗传转化
• 4.2.1 构建载体用菜心作为材料的依据
• 4.2.2 植物材料、菌株及抗生素
• 4.2.3 菜心的遗传转化体系
• 4.2.4 反义表达载体对菜心的遗传转化步骤
• 4.2.5 菜心转BcNAC2反义基因芽系的分子检测
• 4.2.5.1 菜心转BcNAC2反义基因芽系基因组DNA的提取
• 4.2.5.2 菜心转BcNAC2反义基因芽系的PCR检测
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 芜菁BcNAC2基因反义片段的获得
• 4.3.2 反义表达载体的构建
• 4.3.3 反义表达载体农杆菌中质粒的鉴定
• 4.3.4 菜心可以取代芜菁进行遗传转化
• 4.3.5 菜心转BcNAC2反义基因芽系的获得
• 4.3.6. 菜心转BcNAC2反义基因芽系的分子检测
• 4.4 讨论
• 4.4.1 反义技术在基因功能研究中的高效性
• 4.4.2 BcNAC2反义转化抗性芽的分子检测
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的文章