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Calcimycin（A23187）生物合成机理的研究

2020-12-11阅读(550)

Calcimycin（A23187）生物合成机理的研究

论文摘要

Calcimycin （A23187）是重要的聚醚类抗生素,不仅具有抗革兰氏阳性菌的作用,还是哺乳动物细胞的氧化磷酸化的解偶联剂和ATP酶的抑制剂,甚至引起细胞凋亡。Calcimycin （A23187）可特异地结合二价金属阳离子（钙离子、镁离子等）,常用于钙离子穿膜时细胞膜生理属性的研究中。Calcimycin （A23187）的化学结构包含3个部分:α-酮吡咯环、螺旋环和氨甲基取代的苯并噁唑环。同位素喂养实验表明吡咯环来源于脯氨酸,螺旋环来源于2分子的乙酸和4分子的丙酸,苯并噁唑环来源于分支酸途径的3-羟基邻氨基苯甲酸,N-甲基来源于甲硫氨酸。鉴于calcimycin （A23187）独特的化学结构与作用机理,科学家们长期以来对其表现出浓厚的兴趣,自从1972年发现以来,16,000多篇文献报道了calcimycin （A23187）的相关研究,但是其生物合成机理一直悬而未决。本研究旨在分子水平上阐述calcimycin （A23187）的生物合成机理,从而为利用组合生物学手段开发新的药物奠定基础。根据脯氨酸腺苷转移酶的保守氨基酸区域设计兼并引物,通过PCR的方法克隆到了脯氨酸腺苷转移酶基因,进而从教酒链霉菌（Streptomyces chartreusis）NRRL 3882的基因组文库中克隆到了calcimycin （A23187）的生物合成基因簇,并从中挑选p14F11、p16F9和p6F5三个相互重叠的阳性科斯质粒拿去测序。生物信息学显示测定的101 kb的区域含有56个开放阅读框（open reading frame, ORF）,其中的27个ORFs（64 kb）负责calcimycin （A23187）的生物合成。这27个orfs包含: 3个orfs （calN1-N3）负责吡咯环的合成,5个orfs （calA1-A5）编码I型聚酮合酶负责螺旋环的合成,4个orfs （calB1-B4）负责3-羟基邻氨基苯甲酸的合成,1个N-甲基转移酶基因（calM）,1个抗性基因（calT）,1个II型硫酯酶（calG）, 3个调节基因（calR1-R3）, 4个其它基因（calCDFH）和5个未知基因（calU1-U5）。通过同框缺失目标基因,确定了4个基因（calN1、calN2、calB2和calM）跟calcimycin （A23187）的生物合成直接相关,并体外酶活实验证实了CalM催化A23187的最后一步N-转甲基反应。以此为基础结合生物信息学分析和早期的同位素喂养结果成功推测出了calcimycin （A23187）的整个生物合成途径。CalN1是辅氨酰基脱氢酶,催化辅氨酰的脱氢反应,生成吡咯环。CalN2是脯氨酸腺苷转移酶,特异识别并活化脯氨酸。CalB2是异分支酸酶,催化2-氨基-2-脱氧异分支酸（ADIC）生成2,3-二氢-3-羟基邻氨基苯甲酸（DHHA）。CalM是N-甲基转移酶,催化calcimycin （A23187）生物合成的最后一步,使中间产物N-demethyl calcimycin （A23187）生成calcimycin （A23187）。体内中断实验证明,calN1N2B2M与calcimycin （A23187）的生物合成直接相关,calN1、calN2、calB2分别同框缺失的突变株都不仅失去了生产calcimycin （A23187）的能力,同时还失去了生产cezomycin和N-demethyl calcimycin （A23187）这2种中间产物的能力;calM同框缺失的突变株失去了生产calcimycin （A23187）的能力,但是仍然积累了大量的cezomycin和N-demethyl calcimycin （A23187）这2种中间产物;calN2、calM的各自回补菌株都恢复了生产这3种抗生素的能力;CalM的体外酶活实验证明,在S-腺苷甲硫氨酸（SAM）存在下,CalM催化中间产物N-demethyl calcimycin （A23187）生成calcimycin （A23187）,这一结果与体内实验一致。Calcimycin （A23187）的生物合成起始于脯氨酸,经过腺苷化、脱氢等步骤生成吡咯环,接着以吡咯环为起始单元,利用2分子的丙二酰辅酶A和4分子的甲基丙二酰辅酶A作为延伸单元,经过6轮脱缩缩合合成成熟聚酮链,然后CalG（II型硫酯酶,thioesterase, TE）释放线性聚酮链或者聚酮链直接与3-羟基邻氨基苯甲酸缩合生成苯丙噁唑环,接着C3位羟基化、氨基化和N-甲基化,最后生成calcimycin （A23187）。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 符号说明
  • 第一章 文献综述
  • 第一节 链霉菌简介
  • 第二节 聚酮化合物和非核糖体类多肽化合物
  • 2.1 聚酮化合物的生物合成
  • 2.2 非核糖体类多肽化合物的生物合成
  • 2.3 PKS/NRP 或 SNRPS/PKS 的杂合化合物的生物合成
  • 第三节 聚醚类抗生素的研究进展
  • 3.1 聚醚类抗生素的药用价值
  • 3.2 聚醚类抗生素的分类
  • 3.3 聚醚类抗生素的生物合成基因簇
  • 第四节 calcimycin（A23187）的研究进展和背景
  • 4.1 A23187 的化学结构
  • 4.2 A23187 的应用
  • 4.3 A23187 衍生物的生物合成
  • 4.4 A23187 的化学合成
  • 第二章 实验材料和方法
  • 第一节 实验材料
  • 1.1 菌株
  • 1.2 质粒
  • 1.3 本研究所用的 PCR 引物
  • 1.4 培养基和化学试剂
  • 第二节 实验方法
  • 第三章 A23187 生物合成基因簇的克隆和测序
  • 第一节 A23187 生物合成基因簇的克隆
  • 1.1 克隆探针的设计
  • 1.2 教酒链霉菌 NRRL 3882 的基因组文库的筛选
  • 第二节 A23187 生物合成基因簇的序列测定和 ORF 预测
  • 第四章 A23187 生物合成基因簇中几个重要功能基因的缺失
  • 第一节 教酒链霉菌NRRL 3882 野生型的发酵产物的 HPLC/MS 分析
  • 1.1 野生型发酵物的HPLC/MS分析
  • 1.2 野生型发酵物的高分辨质谱 Q-TOF 分析
  • 第二节 脯氨酸腺苷转移酶CalN2 特异识别和活化脯氨酸
  • 2.1 教酒链霉菌 NRRL 3882 中的calN2 的生物信息学分析
  • 2.2 教酒链霉菌 NRRL 3882 中的calN2 的基因置换
  • 2.3 教酒链霉菌 NRRL 3882 中的calN2 的基因置换突变株的 A23187 的生物合成
  • 2.4 教酒链霉菌 NRRL 3882 中的calN2 的基因置换突变株的回补
  • 2.5 教酒链霉菌 NRRL 3882 中的calN2 的基因置换回补菌株的A23187 的生物合成
  • 第三节 酰基辅酶 A 脱氢酶 CalN1 负责辅氨酰基德氧化脱氢反应，生成吡咯环
  • 3.1 CalN1 的生物信息学分析
  • 3.2 教酒链霉菌 NRRL 3882 中的calN1 的基因置换和HPLC 分析
  • 第四节 异分支酸酶Ca182 负责水解2-氨基-2 脱氧异分支酸（ADIC）为2.,3-二氢-3-羟基邻氨苯甲酸（DHHA）
  • 4.1 Ca182 的生物信息学分析
  • 4.2 ca182 的基因置换
  • 第五节 N-甲基转移酶CalM 催化N-demethyl A23187 生成A23187
  • 5.1 CalM 的生物信息学分析
  • 5.2 calM 的基因置换及其突变株的HPLC 分析
  • 5.3 calM 的基因置换突变株的回补及其HPLC 分析
  • 5.4 CalM 的原核表达和纯化
  • 5.5 体外分析CalM的酶活反应
  • 第五章 A23187 生物合成途径的推导
  • 第一节 A23187 生物合成基因簇边界的推测
  • 第二节 A23187 生物合成途径的推导一
  • 2.1 负责吡咯环合成的基因
  • 2.2 负责聚酮链生物合成的基因
  • 2.3 负责3-羟基邻氨基苯甲酸合成的基因
  • 2.4 A23187 生物合成中的抗性基因和调节基因
  • 2.5 A23187 生物合成的其它基因
  • 第三节 A23187 生物合成途径推导二
  • 3.1 聚酮链的释放
  • 3.2 苯并噁唑环的形成
  • 3.3 螺旋环的形成
  • 3.4 C3 位的氨基化和 N-甲基化反应
  • 3.5 聚酮链释放、苯并噁唑环和螺旋环形成、C3 位氨基化和 N-甲基化反应的时间顺序
  • 第六章 总结和展望
  • 第一节 本研究工作总结和主要创新点
  • 第二节 进一步工作和展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读学位期间发表的学术论文和申请的专利

    • 相关论文文献

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