论文摘要
目的:研究胰腺癌SPARC、SARP2基因CpG岛的甲基化分布特征及其与临床生物学特点的关系,以及定量检测方法的建立,并用甲基化基因芯片筛查胰腺癌新的高甲基化异化基因。方法:首先收集23例胰腺及癌旁组织、6例慢性胰腺炎和7例正常胰腺组织作为研究对象,健康成人外周血液标本6例作为对照组。抽提上述标本DNA进行重亚硫酸盐修饰,然后进行PCR扩增SPARC、SARP2基因第一外显子区CpG岛区域,测序明确该区域CpG位点甲基化情况,并与相应的临床生物学特征的关系进行分析。另收集原发性胰腺癌10例、慢性胰腺炎10例和健康志愿者6例外周静脉血10ml,取血清提取所有研究对象的血清DNA,重亚硫酸盐修饰后,行SARP2基因BSP扩增测序。其后制备SPARC和ACTB基因检测标准品,同时设计其定量检测引物和探针,建立SPARC基因定量检测方法。最后用甲基化基因芯片筛查胰腺癌高甲基化异化基因。结果:1.健康人白细胞、正常胰腺、慢性胰腺炎、胰腺癌及癌旁组织SPARC基因第一外显子区CpG位点甲基化率分别0%、12.4%、25.1%、56.8%、37.8%。胰腺癌SPARC基因甲基化率与正常、慢性胰腺炎比较均差别非常显著(P＜0.001),与癌旁比较差别不显著。2.健康人白细胞、正常胰腺、慢性胰腺炎、胰腺癌及癌旁组织DNA中SARP2基因第一外显子区CpG位点甲基化率分别为5.7%、0%、2.5%、37.9%、14.1%;胰腺癌组织与慢性胰腺炎、白细胞及正常胰腺胰组织比较CpG位点甲基化率差别非常显著(P＜0.01),而与癌旁比较差别显著(P＜0.05)。并且这两个基因均有部分CpG位点具有较高的甲基化率。3.在健康对照者、慢性胰腺炎及胰腺癌患者外周循环核酸中也能检测到SARP2基因甲基化,其CpG位点平均甲基化化率分别为:2.2%、10.4%、16.0%,胰腺癌与健康对照组比较差别非常显著(P＜0.01),与慢性胰腺炎比较差别不显著(P＞0.05)。4.制备了SPARC基因甲基化标准品和内参ACTB标准品,初步建立了SPARC基因实时定量检测方法(QMT)。5.初步筛查出了部分胰腺癌高甲基化基因。结论:1.胰腺癌SPARC、SPAR2基因第一外显子区CpG位点具有较高的甲基化率,并且CpG位点甲基化的分布具有不均衡性,部分位点具有胰腺癌特异性,可作为胰腺癌基因诊断的靶点。2.在胰腺癌外周血循环核酸中可以检测到甲基化异化的SARP2基因,因此循环核酸中甲基化异化基因的检测可以用于胰腺癌的基因诊断。3.SPARC基因的甲基化实时定量检测方法稳定、敏感,可用于胰腺癌的基因诊断。4.甲基化基因芯片筛查到了部分胰腺癌高甲基化基因,对于胰腺癌的诊断和防治具有较大意义。