人原发性骨关节炎关节软骨间充质祖细胞生物学特性研究

论文摘要

课题背景:OA是医学临床最常见的骨关节疾病,为目前导致中老年人残障的第二大病因（仅次于心脑血管疾病）。OA分为原发性（特发性）和继发性两类。研究表明,原发性OA是关节软骨损伤与修复失衡所致;MSCs具有自我更新和多向分化潜能,在一定条件下被激活后,可大量增殖并向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等方向分化,在维持组织自身稳定和修复病变组织中起着至关重要的作用;bFGF和TGF-β1具有显著的促MSCs增殖的作用;核结合蛋白SOX6和SOX9是诱导MSCs成软骨分化相关基因表达的必要因子,是成软骨分化的关键开关。新近研究发现正常人和原发性OA患者关节软骨内存在具有MSCs特性的MPCs,且原发性OA关节软骨内MPCs的数量较正常关节软骨内MPCs增多。而原发性OA和正常人关节软骨内MPCs的生长和增殖特性及其成软骨、成骨和成脂分化能力,以及在原发性OA发生和发展中起的作用如何;bFGF和TGF-β1对关节软骨MPCs的促增殖作用,SOX6和SOX9对MPCs的成软骨分化作用,目前尚未见相关研究报道。因此,观察比较原发性OA及正常人关节软骨MPCs的生长和增殖特性及其成软骨、成骨和成脂分化能力及其在关节软骨退变及原发性OA发生和发展中的作用,可为探讨关节软骨退变及原发性OA发病的机制提供新思路;同时观察相关生物因子对OA关节软骨MPCs的促增殖和成软骨分化的作用,可为通过调控关节软骨MPCs以防治原发性OA提供理论依据。目的:观察比较原发性OA及正常人关节软骨MPCs的生长和增殖特性及其成软骨、成骨和成脂分化能力,明确关节软骨MPCs在原发性OA发病中的重要作用;观察bFGF和TGF-β1对原发性OA关节软骨MPCs的促增殖作用,以及SOX6和SOX9对其MPCs的成软骨分化作用,为通过调控关节软骨MPCs以防治原发性OA提供理论依据。方法:1.采用改良酶消化分离法观察比较原发性OA及正常人关节软骨单位湿重的细胞含量。采用免疫磁珠法,以CD105、CD166为标志物,分别于原代培养原发性OA及正常人关节软骨细胞中,分选其关节软骨MPCs,并分别计算其阳性细胞比率和存活率,流式细胞仪检测分选细胞表面的分子表型,对比观察原发性OA及正常人关节软骨MPCs的细胞数量、生长特性、细胞增殖的变化。2.观察原发性OA及正常人关节软骨MPCs成软骨（微团培养）诱导分化后的细胞形态变化,TB、Ⅱ型胶原、aggrecan染色,GAG含量及Ⅱ型胶原mRNA表达;成骨（单层传代培养）诱导分化后细胞形态变化,钙结节染色,ALP活性及BGPmRNA表达;成脂（单层传代培养）诱导分化后细胞形态变化,油红染色,油红染色阳性细胞比率及TG含量。3.采用MTT法测定不同浓度bFGF和TGF-β1单独或联合作用下对原发性OA关节软骨MPCs的增殖作用。分别以pAdTrack-CMV-SOX6、SOX9腺病毒穿梭质粒构建SOX6、SOX9基因,并感染原发性OA关节软骨MPCs,比较基因感染组和未感染组成软骨诱导分化后,TB、II型胶原以及II型胶原mRNA表达的变化。结果:1.原发性OA关节软骨单位湿重的细胞含量为1.55±0.16（106个细胞/g）仅为正常人关节软骨细胞数（3.57±0.18）的41.3%。原发性OA及正常人关节软骨细胞中的CD105+细胞比率分别为95.7±1.16、95.2±1.18（%）,CD166+为6.8±0.26、6.6±0.19,CD105+/CD166+为4.5±0.09、4.6±0.07,二者之间均无统计学差异（P值均>0.05）;分选细胞存活率为93-95（%）;经流式细胞仪检测,其分选原发性OA及正常人关节软骨MPCs的CD105+分别为96.5±1.12、95.5±1.16,CD166+为96.8±1.26、97.5±1.31,CD105+/CD166+细胞分别为93.5±1.09、94.6±1.13,而CD34+、CD45+细胞仅为0.5±0.012、0.4±0.01及0.8±0.014、0.6±0.011。与正常人关节软骨MPCs比较,原发性OA关节软骨MPCs的生长速度和增殖速率较快。2.原发性OA及正常人关节软骨MPCs成软骨诱导分化后细胞TB、Ⅱ型胶原、aggrecan染色均呈阳性,原发性OA者GAG含量减少及Ⅱ型胶原mRNA表达减弱（P<0.05）;成骨诱导分化后细胞钙结节染色均呈阳性,原发性OA者ALP含量减少及BGPmRNA表达减弱（P<0.05）;成脂诱导分化后细胞油红染色均呈阳性,原发性OA者TG含量增加（P<0.05）。3.10～50ng/ml的bFGF、0.1-1.0ng/ml的TGF-β1单独作用于传代培养原发性OA关节软骨MPCs时,其培养细胞的增殖速率显著增加（P<0.05）,而随着二者浓度的进一步增加,其增殖速率无显著变化（P>0.05）;bFGF10ng/ml+TGF-β11.0ng/ml联合作用时,对原发性OA关节软骨MPCs具有明显促增殖作用（P<0.05）。SOX6和SOX9能够分别稳定感染OA关节软骨MPCs;经二者分别感染的关节软骨MPCs成软骨诱导分化后,其TB染色、II型胶原染色呈强阳性表达,未基因感染细胞为弱阳性着色;SOX6基因感染原发性OA关节软骨MPCs的II型胶原mRNA表达量为未基因感染细胞的3.8倍（P<0.01）,SOX9基因为未感染细胞的5.15倍（P<0.01）。结论:1.原发性OA关节软骨内的细胞含量显著少于正常人关节软骨。原发性OA及正常人关节软骨存在MPCs;相同数量的原发性OA及正常人关节软骨中分选出的关节软骨MPCs数量相同。原发性OA关节软骨MPCs的生长与增殖较正常人关节软骨MPCs活跃。据此推测单位体积关节软骨中,原发性OA关节软骨MPCs数量可能明显少于正常人关节软骨,并提示关节软骨MPCs在原发性OA病理过程中具有重要作用。2.关节软骨MPCs经成软骨、成骨及成脂诱导后均能分化为具有相应功能细胞特性的分化细胞;原发性OA关节软骨MPCs成软骨和成骨分化能力降低,而成脂分化能力增加,提示原发性OA关节软骨MPCs分化功能出现异常,OA关节软骨细胞对软骨损伤修复能力降低。3.bFGF、TGF-β1对原发性OA关节软骨MPCs增殖具有重要作用,不同浓度的bFGF、TGF-β1及bFGF+TGF-β1促增殖作用不同。构建的SOX6、SOX9基因序列与基因库报道序列完全一致;SOX6和SOX9能稳定感染原发性OA关节软骨MPCs,并显著促进感染细胞成软骨分化。提示通过适宜浓度的bFGF、TGF-β1对原发性OA关节软骨MPCs的作用及SOX6和SOX9基因感染,可能具有促进原发性OA关节软骨损伤修复的作用。

论文目录

• 英文缩写一览表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 正文 人原发性骨关节炎关节软骨间充质祖细胞生物学特性研究
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 人原发性骨关节炎关节软骨间充质祖细胞分选、鉴定及其生长与增殖特性研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 人原发性骨关节炎关节软骨间充质祖细胞成软骨、成骨及成脂分化研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三部分 相关生物因子对人原发性骨关节炎关节软骨间充质祖细胞增殖和成软骨分化调控作用的研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢
• 文献综述 关节软骨细胞及其相关因子在骨关节炎发病中的作用研究进展
• 参考文献
• 博士在读期间发表文章
• 英文论著