论文题目: 表达人骨形态发生蛋白-7的骨髓基质细胞修复骨缺损的实验研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 肿瘤学
作者: 李晓燕
导师: 郭亚军,陈列平,王皓,戴建新,赵健
关键词: 骨形态发生蛋白,真核表达,基因治疗,腺病毒,骨髓基质细胞,支架材料,动物实验
文献来源: 第二军医大学
发表年度: 2005
论文摘要: 由于感染,火器伤以及良恶性肿瘤造成的骨缺损及骨不连等疾病一直是骨科临床治疗的难题,长期以来,自体骨移植成为首选的治疗方案,但该方法创伤大,容易发生感染等术后并发症,因此研究人员和临床医师一直在寻找合适的药物治疗方案。 1965年,Urist在动物实验中证实了盐酸脱钙异体骨有骨诱导能力,并预言了骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)的存在。1990年英国剑桥大学遗传学研究所的Celeste从人胎盘和胎脑基因组文库中获得了骨形态发生蛋白-7(BMP-7)的cDNA,同年,美国哈佛大学分子生物研究所的Ozkaynak从人基因组文库中克隆出成骨蛋白-1(osteogenic protein-1,OP-1)的序列,经核苷酸、氨基酸序列比较确定二者为同一种物质。该蛋白为β一转化生长因子(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族成员,是一个同源双链的酸性糖蛋白,研究表明BMP-7可跨种属诱导成骨而且新骨生成迅速,其生成量与BMP-7植入量呈正相关。由于BMP-7在天然骨组织中含量极少,1公斤湿骨仅能提取1毫克BMP-7蛋白,所以研究人员试图用基因工程方法获得足量BMP-7蛋白以用于临床治疗。国外已有研究机构利用DNA重组技术得到了BMP-7纯品,例如在美国,经FDA批准,BMP-7作为第一个用于临床骨科的基因工程药物进入临床试验;而在澳大利亚,BMP-7已经获准进入临床使用。但是到目前为止,国内只有关于BMP-7在大肠杆菌和昆虫细胞中表达的报道,大肠杆菌属于原核表达系统,它不能对蛋白进行正确的剪切加工和糖基化,因此,表达的BMP-7蛋白是否有活性尚无定论,而昆虫细胞利用了杆状病毒表达系统,其体内应用的安全性仍在研究中。研究证明哺乳细胞表达系统(如CHO表达系统)是基因工程表达蛋白的首选方法,CHO细胞能对蛋白进行正确地翻译、加工、折叠和糖基化,从而表达出具有生物活性的蛋白,而有活性对于BMP-7应用于临床是至关重要的。因此,本研究利用CHO表达系统得到了BMP-7高表达细胞株,实验证明CHO细胞能够分泌有体外诱骨活性的BMP-7蛋白。 虽然BMP-7具有细胞因子的特点,用量极少而能发挥极大的作用,但应用于体内的BMP-7蛋白量仍需达到毫克级,而且BMP-7进入体内后易随体液流失降解,半衰期短,不能局限在骨缺损部位发挥作用,因此必须寻找更有效的替代
论文目录:
缩略词表
中文摘要
英文摘要
前言
第一部分 hBMP-7 cDNA序列的克隆及相关载体的构建
实验一 克隆hBMP-7 cDNA全长序列
材料和方法
结果
实验二 真核表达载体及重组腺病毒载体的构建
材料和方法
结果
讨论
参考文献
第二部分 建立稳定表达BMP-7的CHO细胞表达系统
实验一 CHO细胞克隆的筛选及BMP-7生物活性检测
材料和方法
结果
实验二 BMP-7纯化方案的建立
材料和方法
结果
讨论
参考文献
第三部分 腺病毒介导的BMP-7促进骨缺损愈合的动物实验研究
实验一 分离兔骨髓基质细胞及检测植入材料的生物相容性
材料和方法
结果
实验二 AdCMV-BMP-7的体外表达水平及诱骨活性检测
材料和方法
结果
实验三 AdCMV-BMP-7促进骨缺损愈合的动物实验研究
材料和方法
结果
讨论
参考文献
论文小结
综述 骨形态发生蛋白家族研究发展史
致谢
发布时间: 2005-09-21
参考文献
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