结合珠蛋白基因多态性与中国人冠心病的关联研究

论文摘要

背景冠心病（Coronary heart disease，CHD）是严重危害人体健康、影响生活质量的常见病。遗传流行病学研究显示，冠心病的发病与遗传因素密切相关，且与机体内氧化应激、炎症反应增强和内环境不稳定密切相关。结合珠蛋白（Haptoglobin，Hp）又称触珠蛋白，是一种酸性糖蛋白，属急性期反应蛋白之一，研究表明Hp具有抗氧化活性，有抑制前列腺素合成、促进血管生成及调节机体免疫等功能。结合珠蛋白广泛存在于人类和许多哺乳动物的血清及其他体液中，其主要功能是通过与游离血红蛋白（heamoglobin，Hb）结合形成Hp2Hb复合物，并很快被单核-巨噬细胞系统介导的清道夫受体CD163清除掉，防止了血红蛋白对组织的氧化损伤，同时也阻止了血红蛋白从肾小球滤过，避免了游离血红蛋白对肾小管的损害。人类Hp基因位于染色体16q22.1，存在两个等位基因的多态性Hp1与Hp2，可以形成常见的三种基因型Hp1-1，Hp2-1和Hp2-2。Hp2等位基因包含一个长1.7kb的基因内重复序列而Hp1没有，Hp2等位基因看上去似乎是由两条Hp1-α链等位基因独特的非同源重组形成。这样可以根据Hp不同基因型的结构差异来设计相应的引物进行扩增而对特定人群Hp基因进行分型。Asleh等人通过用放射线标记的Hp与CD163在细胞株中转染之后在巨噬细胞中表达内源性CD163发现，CD163清除Hp1-1-Hb的能力要显著强于Hp2-2-Hb，丽清除Hp2-1-Hb的能力居中。此外，结合珠蛋白作为一种急性期蛋白，在参与宿主抗感染、损伤组织的修复以及内环境稳定的过程中起着重要作用，其血清含量在感染、创伤、炎症、肿瘤、心肌梗死等病理状态时显著升高。除以上的功能外，Hp尚有抑制前列腺素合成、抑制细菌、促进血管生成及重要的免疫作用，Hp以上抗氧化、抗炎、对损伤组织的修复及促进血管生成等生理功能均与抑制冠心病的发生发展密切相关。由于Hp具有遗传多态现象，而且不同的基因型具有不同的结构及生理功能，近年来，研究Hp基因多态性与冠心病的发生发展已成为一个新的重要课题。有研究表明Hp2-2基因型与冠心病的发生密切相关，尤其是在阻塞性睡眠呼吸暂停综合征和糖尿病患者等高危人群中，同样也研究发现Hp2-2基因型是冠心病转归与预后的不利因素。基于Hp基因可通过影响机体内氧化及炎症反应，可能参与了动脉粥样硬化的进程，而且不同的种族和地域Hp基因多态性可能存在一定的差异，目前国内尚无有关Hp基因多态性与冠心病相关性研究的报道，因此对中国汉族人中该基因多态性和冠心病的相关性的探讨是可行和值得的。目的本研究通过检测浙江地区中国汉族人Hp基因多态性频率，以探讨Hp基因多态性与冠心病发生发展的关系。对象与方法一、研究对象冠心病组：冠心病患者189例，均选自2005年3月至2005年12月浙江大学医学院附属第二医院心内科病房住院病人，符合世界卫生组织（WHO）关于缺血性心脏病的命名及诊断标准，所有患者经冠状动脉造影证实。其中男性149例，女性40例，平均年龄63.14±10.38岁。对照组：对照组242例，均选自同期浙江大学医学院附属第二医院心内科病房住院病人，所有入选者经冠状动脉造影检测完全正常。其中男性175例，女性67例，平均年龄61.56±10.44岁。本研究人群个体之间无血缘关系。二、冠心病的诊断冠状动脉造影时，分别对右冠状动脉、左冠状动脉前降支、左旋支和左主干狭窄病变程度进行评价。各主要分支存在＞50％狭窄定义为有意义病变，诊断为冠心病。三、冠心病危险因子调查设计冠状动脉粥样硬化登记调查表，详细记录每一患者的临床表现，辅助检查，化验检查结果，危险因素及冠心病家族史。冠心病经典危险因子按下述标准定义：1．高脂血症采用2006年血脂异常防治指南，为血清总胆固醇（TC）≥200mg／dl或／和甘油三酯（TG）≥150mg／dl或／和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）≥120mg／dl和／或高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）≤40mg／dl。2．高血压采用1999年世界卫生组织和国际高血压学会（WHO／ISH）的标准定义和诊断。3．糖尿病符合1997年美国糖尿病学会（ADA）糖尿病诊断标准。4．吸烟指目前吸烟和既往吸烟已经戒烟者。四、基因组DNA抽提和Hp基因多态性检测1．白细胞基因组DNA抽提：以酚／氯仿法提取外周血白细胞DNA。2．Hp基因多态性检测：参考Werner Koch的PCR实验方法，分别用引物P1和P2扩增Hp1特异片段，引物P3和P4扩增Hp2特异片段。上游引物P1：5’-GCTGTCACTGCTGCGTAAAG-3下游引物P2：5’-GGTCAGTCTTTGGTTGGGTAG-3’扩增Hp1特异性片段。PCR反应体系：模板DNA（100ng／μl） 1μl10×Reaction buffer（without MgC12） 2μl25mm MgCl2 2μl10mm dNTP 0.5μl10μM上下游引物各0.5μlTakara LA Tag DNA聚合酶（5U／L） 0.4μlDdH2O 13.1μlTotal Volume 20μl上游引物P3：5’-CCTGCCTCGTATTAACTGCACAT-3下游引物P4：5’-CCGAGTGCTCCACATAGCCATGT-3’扩增Hp2特异性片段，反应体系与上相同。扩增条件：在PCR热循环仪上扩增，95℃预变性3分钟，95℃变性1分钟，69℃退火和延伸2分钟（P1和P2扩增时）或1分钟（P3和P4扩增时），共35个循环后72℃终末延伸7分钟。PCR产物以0.7％（Hp1特异片段产物）或1％（Hp2特异片段产物）琼脂糖凝胶（含溴乙锭5μg／ml）电泳，经70伏特20分钟，在紫外光下观察，摄影。五、统计分析资料输入数据库，应用SPSS11.5软件包作统计学处理。连续变量以均数±标准差（（?）±S）表示，计数资料以频数和构成比表示。运用Hardy-Weinberg平衡检验确认研究样本的群体代表性。多组均数间比较采用方差分析，两组均数间比较采用t检验，非正态分布和方差不齐的资料采用非参数统计。计算各组基因型分布，等位基因频率，并行χ2检验。所有结果在P＜0.05时视为有统计学意义。结果一．研究对象的Hardy-Weinberg平衡中国浙江汉族研究对象符合Hardy-Weinberg平衡，对照组和冠心病组χ2值分别为1.364和0.007，P均＞0.05。二．浙江地区非冠心病患者汉族人的Hp基因多态性分布在中国汉族冠脉造影正常人群中，Hp1-1、Hp2-1、Hp2-2基因型频率分别为0.13，0.52，0.35。Hp1与Hp2等位基因的频率分布为0.39，0.61。三．冠心病组与对照组Hp基因多态性的比较冠心病组及急性冠脉综合征（Acute coronary syndrom，ACS）亚组Hp基因型分布与对照组相比具有显著差异（P均＜0.01），表现为冠心病患者及ACS亚组的Hp2-2频率明显高于健康对照组（0.54、0.57vs0.35，P均＜0.01），Hp2等位基因的频率也明显高于对照组（0.74、0.76vs0.61，P均＜0.01）。四．Hp基因多态性与冠心病危险因子的关系冠心病组Hp基因多态性与冠心病危险因子比较，可见Hp基因型分布与冠心病年龄、性别、收缩压、舒张压、总胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）、低密脂蛋白（LDL）、高密脂蛋白（HDL）以及高血压、糖尿病和吸烟均无显著差异（P均＞0.05）。五．冠心病组Hp基因多态性与心血管家族史的比较冠心病患者中有／无家族史Hp基因型及等位基因频率相比无显著差异（P＞0.05）。结论1．浙江地区汉族人群存在Hp基因多态性，冠脉造影正常人群Hp1-1、Hp2-1、Hp2-2基因型频率分别为0.13，0.52，0.35，Hp1与Hp2等位基因的频率分布为0.39，0.61。为在我国汉族人群中进行Hp基因多态性与疾病的关联研究提供了该基因分布的参考数据。2．Hp2-2基因型与中国汉族人群冠心病发生发展有关，Hp2-2基因型增加冠心病及急性冠脉综合征发生的危险。Hp2等位基因可能是中国汉族人发生冠心病的易感基因。3．在冠心病组及总体样本中，Hp基因多态性与冠心病经典危险因子无关，Hp2-2基因型可能是冠心病的独立危险因素。4．Hp基因多态性与冠心病心血管病家族史均无关系。

论文目录

• 一、论文摘要
• 中文
• 英文
• 二、正文
• 前言
• 对象与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 三、综述
• 正文
• 参考文献
• 四、致谢