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广谱抗病（GO）基因转入水稻恢复系的研究

2020-12-03阅读(1045)

广谱抗病（GO）基因转入水稻恢复系的研究

论文摘要

本研究通过有性杂交方式将葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase,GO）基因从粳稻（Oryza sativa L.ssp.japonica）日本晴（Nipponbare）转入籼稻（O.sativassp.Indica）蜀恢162（shuhui 162）,经RT-PCR分子鉴定和淀粉-KI显色反应确定GO基因已导入籼稻蜀恢162。GO基因籼稻蜀恢162F1分别与乐恢188和缙恢21进行有性杂交。采用生理生化方法对GO基因籼稻蜀恢162F1及其复交F1材料叶片进行过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、超氧化物岐化酶（SOD）活性检测和POD同工酶电泳分析。抗性鉴定稻瘟病菌诱发的GO基因蜀恢162F1及其复交F1。结果如下:（1） RT-PCR分子鉴定结果证明了有性杂交方式在水稻亚种间转GO基因的可行性,GO基因已在分子水平整合和转录进蜀恢162基因组;淀粉—KI显色反应结果说明GO基因已在蛋白质水平表达。（2）无论是经稻瘟病诱发的植株,还是未经稻瘟病诱发的植株,GO基因籼稻蜀恢162F1及其复交F1材料叶片的POD、CAT、SOD活性均比对照提高;未感病植株材料叶片POD、CAT、SOD活性高于感病植株材料叶片;转基因植株POD同工酶电泳条带显色比非转基因植株更深。说明GO基因已在籼稻蜀恢162F1中蛋白质水平表达并发挥作用;GO基因已转入复交F1材料并发挥抗病作用。（3）叶瘟病抗性鉴定:转基因籼稻蜀恢162F1抗性评价为中抗（MR）,而对照为高感（HS）。日本晴（GO）/蜀恢162//乐恢188F1植株中有80%表现为抗（R）,而对照高感（HS）为79%。日本晴（GO）/蜀恢162//缙恢21F1植株中有78%为抗（R）,而对照中感（MS）为25%,感（S）为31%,高感（HS）为22%。经DPS分析,除日本晴（GO）/蜀恢162//缙恢21F1植株中有1个株系外,其余株系均与对照存在显著性差异关系。日本晴（GO）/蜀恢162//缙恢21F1的病情指数高于日本晴（GO）/蜀恢162//乐恢188F1的病情指数。说明转基因籼稻对稻瘟病具有明显的抗性,且GO基因的再次转育取得成功,只是在不同品系中的转育成功率和抗性有所差异。（4）颈瘟病抗性鉴定:葡萄糖氧化酶基因杂交后代株系的抗病性比其对照要强,非GO基因后代株系中出现高感稻瘟病的单株较多;不同遗传背景的GO基因后代株系,抗病单株出现的频率有较大差异,说明GO基因在不同遗传背景中表达强度不一致。（5）本研究是基因工程与常规育种相结合的成功应用。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 1 研究背景及研究意义
  • 1.1 转基因方法的研究
  • 1.2 转基因植物中外源基因的转育
  • 1.3 葡萄糖氧化酶基因工程研究现状
  • 1.4 转基因植物的安全性
  • 1.5 植物基因工程的抗病机制
  • 1.5.1 植物抗性反应机制
  • 1.5.2 过氧化氢的广谱抗病性机理
  • 1.5.3 过氧化氢与POD、SOD、CAT关系
  • 1.6 抗稻瘟病基因的研究进展
  • 1.7 RT-PCR的应用优势
  • 1.8 立题依据
  • 2 实验设计与方法
  • 2.1 实验材料
  • 2.2 GO基因的转育
  • 2.3 GO基因表达鉴定
  • 2.3.1 RNA提取步骤
  • 2.3.2 RNA质量检测
  • 2.3.3 RT-PCR
  • 2.3.4 琼脂糖凝胶电泳检测
  • 2.4 POD同工酶电泳及染色
  • 2.5 酶活性测定
  • 2.5.1 取样方法
  • 2.5.2 粗酶液提取
  • 2.5.3 超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定
  • 2.5.4 过氧化物酶（POD）活性的测定
  • 2.5.5 过氧化氢酶（CAT）活性的测定
  • 2.5.6 实验数据处理与分析
  • 2.6 过氧化氢检测
  • 2.7 抗稻瘟病检测
  • 2.7.1 实验准备
  • 2.7.2 步骤
  • 2.7.3 叶瘟、穗颈瘟抗性鉴定
  • 2.7.4 病级记载标准以及病级划分标准
  • 2.8 实验数据处理与分析
  • 2.9 GO基因的实验路线
  • 3 实验结果与分析
  • 3.1 GO基因表达鉴定结果
  • 3.1.1 RNA纯度鉴定
  • 3.1.2 RT-PCR检测结果
  • 3.2 过氧化氢检测结果
  • 3.3 过氧化物（POD）同工酶
  • 3.4 GO基因对SOD、POD、CAT活性的影响
  • 1与非转基因植株酶活性比较'>3.4.1 未经稻瘟病诱发GO基因蜀恢162F1与非转基因植株酶活性比较
  • 1植株与其对照的酶活性比较'>3.4.2 经稻瘟病诱发的转GO基因复交F1植株与其对照的酶活性比较
  • 3.4.3 结果与分析
  • 3.5 稻瘟病抗性鉴定
  • 3.5.1 叶瘟抗性鉴定
  • 3.5.2 颈瘟
  • 3.5.3 结果分析
  • 4 讨论与结论
  • 4.1 葡萄糖氧化酶基因的转育
  • 4.2 POD同工酶分析
  • 4.3 CAT、POD、SOD活性
  • 4.4 叶瘟、颈瘟抗性鉴定
  • 4.5 抗性基因的遗传稳定性
  • 4.6 转GO基因植株的遗传变异
  • 4.7 转基因安全性评价
  • 1技术利用路线'>4.8 GO基因蜀恢162F1技术利用路线
  • 参考文献
  • 致谢
  • 在读期间发表的论文

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