抗人HAb18G/CD147胞外区蛋白单抗的制备及功能研究

论文摘要

肝癌相关抗原HAb18G是一种高度糖基化的膜蛋白分子。应用肝癌特异性单抗HAb18从人肝癌cDNA文库中筛选得到其相应cDNA序列,查询Genebank证实HAb18G氨基酸序列同CD147分子相同。与基质金属蛋白酶诱导因子（EMMPRIN）、Basigin、Nureothelin等同属CD147家族。以往研究表明,HAb18G/CD147可刺激成纤维细胞分泌较高水平的基质金属蛋白酶（MMPs）,降解基底膜和细胞间质。此外,HAb18G/CD147还是一个潜在的黏附分子,其可通过与integrin家族α3β1、α6β1形成蛋白复合物,进而参与细胞与细胞、细胞与基质的黏附。上述功能的发挥,很大程度上依赖于其胞外区片段（extracellular domain,ed）的表达及糖基化修饰作用。故HAb18G/CD147胞外区（HAb18Ged）是其主要功能区,亦为本实验所使用的免疫原。本研究旨在建立稳定分泌抗人HAb18Ged蛋白单抗的杂交瘤细胞株,获得纯化抗体,鉴定目的抗体的理化性质及特异性,并进一步研究抗体的体内外生物学功能。 本实验共分三部分。首先,以HAb18Ged免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术,融合并筛选分泌抗人HAb18Ged蛋白单抗的杂交瘤细胞株,制备腹水,采用离子交换层析法纯化该抗体。以RT-PCR法扩增单抗的轻、

论文目录

• 缩略语中英文对照表
• 前言及文献回顾
• 1 单克隆抗体药物研发进展
• 1.1 抗体药物发展历程
• 1.2 国内外单克隆抗体药物研发进展
• 2 HAb18G／CD147的研究进展
• 2.1 HAb18G／CD147的发现
• 2.2 CD147分子的结构特征
• 2.3 HAb18G／CD147分子的功能特性
• 3 间质胶原酶和明胶酶的研究进展
• 3.1 MMPs简介
• 3.2 间质胶原酶和明胶酶的研究进展
• 实验内容
• 第一部分 抗人HAb18G／CD147胞外区蛋白单抗的制备及其轻、重链可变区基因的克隆与分析
• 1 实验材料
• 1.1 细胞系及实验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要缓冲液
• 1.4 主要仪器
• 2 方法与步骤
• 2.1 建立分泌鼠抗人HAb18G／CD147胞外区蛋白单抗杂交瘤细胞株
• 2.2 染色体核型鉴定
• 2.3 制备小鼠腹水
• 2.4 单抗HAb18Gedomab1、2的纯化鉴定
• 2.5 单抗HAb18Gedomab1、2重、轻链可变区基因的克隆与分析
• 3 实验结果
• 3.1 杂交瘤细胞株的建立
• 3.2 杂交瘤细胞株染色体鉴定结果
• 3.3 小鼠腹水的制备
• 3.4 单抗纯化鉴定结果
• 第二部分 抗人HAb18G／CD147胞外区蛋白单抗的特异性鉴定
• 1 实验材料
• 1.1 细胞系
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要缓冲液
• 1.4 主要仪器
• 2 方法与步骤
• 2.1 单抗效价的测定
• 2.2 单抗免疫球蛋白亚型鉴定
• 2.3 单抗相对亲和力的测定
• 2.4 流式细胞术检测单抗HAb18Gedomab1、2与FHCC-98细胞膜抗原的结合情况
• 2.5 免疫组化
• 3 实验结果
• 3.1 效价测定结果
• 3.2 免疫球蛋白亚型鉴定结果
• 3.3 相对亲和力检测结果
• 3.4 流式细胞术检测结果
• 3.5 免疫组织化学检测结果
• 第三部分 抗人HAb18G／CD147胞外区蛋白单抗的生物学功能
• 1 实验材料
• 1.1 细胞系及实验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要缓冲液
• 1.4 主要仪器
• 2 方法与步骤
• 2.1 改良的明胶酶谱实验检测单抗对FHCC-98与3T3细胞共培养时分泌明胶酶的影响
• 2.2 改良的明胶酶谱实验检测单抗对不同种细胞不同培养方式分泌明胶酶的影响
• 2.3 Ⅰ型胶原酶谱实验检测单抗对FHCC-98与3T3细胞共培养时分泌的MMP-1、MMP-8的影响
• 2.4 Ⅰ型胶原酶谱实验检测单抗对不同种细胞不同培养方式分泌MMP-1、MMP-8的影响
• 2.5 重组基底膜降解实验测定单抗对FHCC-98侵袭力的影响
• 2.6 单抗对FHCC-98趋化运动能力的影响
• 2.7 粘附实验检测单抗对FHCC-98与细胞外基质粘附力的影响
• 2.8 鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成实验
• 2.9 小鼠体内Matrigel Plug诱导血管生成实验
• 3 实验结果
• 3.1 共培养的明胶酶谱实验结果
• 3.2 不同种细胞不同培养方式的明胶酶谱实验结果
• 3.3 共培养的Ⅰ型胶原酶谱实验结果
• 3.4 不同种细胞不同培养方式的Ⅰ型胶原酶谱实验结果
• 3.5 重组基底膜降解实验结果
• 3.6 趋化运动实验结果
• 3.7 粘附实验结果
• 3.8 鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成实验
• 3.9 小鼠体内Matrigel Plug诱导血管生成实验结果
• 第四部分 讨论
• 结论
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢