Hsp27与PIMT在乳腺癌细胞中的相互作用研究

论文摘要

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一,其复发和转移是患者死亡的主要原因。Hsp27作为小分子伴侣蛋白,在乳腺癌的侵袭、转移和耐药过程中发挥重要作用,但具体的调控机理尚不清楚。为了研究Hsp27在乳腺癌细胞中参与调控的分子机制,本实验室应用免疫共沉淀偶联质谱技术,鉴定出17个与Hsp27相互作用的蛋白质,其中包括蛋白质L-异天冬氨酸甲基转移酶（Protein L-isoaspartyl Methyltransferase,PIMT）。PIMT是一种胞内广泛存在的蛋白修复酶,同Hsp27一样,也参与细胞的应激反应和癌细胞的分化与迁移。有文献报道,PIMT和Hsp27都与PI3K/Akt和MAPK信号调控通路有关,并且它们都参与癫痫的调控。提示它们可能在疾病的作用机理中发挥重要的功能。因此,进一步验证Hsp27与PIMT之间的相互作用,探索它们在乳腺癌中的作用机制,不仅可以阐明乳腺癌发病的分子机制,还能为临床上寻找新的诊断和治疗靶点。本文旨在验证Hsp27与PIMT的相互作用,探索它们在乳腺癌中的作用机制。方法:利用基因重组技术构建带GST标签的重组表达载体pGEX-4T-1-Hsp27,并对GST-Hsp27和6×His-PIMT重组载体进行表达纯化和SDS-PAGE与质谱鉴定,以及应用GST融合蛋白沉降实验（GST pull-down）和Western Blot验证GST-Hsp27和6×His-PIMT在体外的相互作用;用特异性一抗和带Alexa Fluor? 546/488荧光标记的二抗对MCF-7L细胞中内源性Hsp27和PIMT进行免疫双荧光标记,通过激光共聚焦显微术观察它们在细胞内的共定位。结果:成功构建了GST-Hsp27原核表达载体,并对GST-Hsp27和6×His-PIMT重组载体进行了表达纯化和SDS-PAGE与质谱验证,通过GST pull-down实验,在体外证明了它们之间的直接相互作用;免疫双荧光标记偶联激光共聚焦显微术观察显示Hsp27和PIMT在乳腺癌细胞株MCF-7L细胞质内共定位。结论:我们首次发现并证明了Hsp27与PIMT存在相互作用,推测这种相互作用可能在乳腺癌的作用机理中发挥重要功能。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略表
• 第一章 前言
• 1 乳腺癌
• 2 热激蛋白27（Hsp27）
• 3 蛋白质L-异天冬氨酸甲基转移酶（PIMT）
• 4 蛋白质相互作用的研究方法
• 5 研究目的与意义
• 第二章 材料与方法
• 1 实验材料
• 2 主要试剂
• 3 实验仪器
• 4 分析软件
• 5 溶液配制
• 6 实验方法
• 第三章 实验结果
• 1 pGEX- 4T-1-Hsp27 重组载体的构建
• 2 GST-Hsp27、6×His-PIMT 和GST 基因表达、纯化及鉴定
• 3 GST pull-down 技术验证Hsp27 与PIMT 的体外相互作用
• 4 免疫共定位技术验证Hsp27 与PIMT 的体内相互作用
• 第四章 讨论
• 第五章 结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 发表论文情况