蝎神经毒素AaIT的表达及功能分析

论文摘要

在不改变氨基酸编码序列的情况下,根据大肠杆菌密码子偏爱性,设计并合成了适合于大肠杆菌表达的蝎神经毒素AaIT基因。将该基因克隆到大肠杆菌表达载体pET15b和pET32a+中,构建得到重组质粒pET15b-AaIT和pET32a-AalT。将重组质粒pET15b-AaIT转入带有trxB突变的大肠杆菌AD494（DE3）中,得到的重组菌株经IPTG诱导,表达产物形成包涵体。将重组质粒pET32a-AaIT转入带有trxB/gor双突变的大肠杆菌Origami（DE3）,经IPTG诱导后获得可溶性表达产物,但该表达产物没有生物学活性。把此基因插入到含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC6αA构建重组质粒pPIC6αA-AaIT,转化毕赤酵母X-33,经甲醇诱导后,获得高水平的分泌表达（20mg/l）。表达产物喂食银纹夜蛾及甜菜夜蛾没有表现出生物活性,经注射有活性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 目录
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 蝎毒
• 1.1.1 蝎长链神经毒素的蛋白质序列、分类与生物功能
• 1.1.2 蝎长链神经毒素的高级结构
• 1.1.3 蝎神经毒素AaIT
• 1.2 大肠杆菌表达系统的改良
• 1.3 醉母菌的表达系统
• 1.3.1 酵母菌的载体
• 1.3.2 巴斯德毕赤酵母表达系统
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株、质粒以及目的基因
• 2.1.2 供试虫
• 2.1.3 主要工具酶与试剂
• 2.1.4 药品及培养基
• 2.1.5 寡核苷酸引物的合成
• 2.1.6 培养基及溶液的配制
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 PCR产物的回收与纯化
• 2.2.2 大肠杆菌的转化
• 2.2.3 碱裂解法提取质粒DNA
• 2.2.4 含重组质粒的大肠杆菌的诱导表达
• 2.2.5 大肠杆菌基因工程蛋白的粗提取
• 2.2.6 Ni2+柱亲和层析法纯化带His6标记的蛋白
• 2.2.7 蛋白质浓度以及目的蛋白占总蛋白的含量的测定
• 2.2.8 重组表达质粒转化Pichia pastoris X-33
• 2.2.9 重组酵母菌X-33的筛选与鉴定
• 2.2.10 AaIT在酵母中的诱导表达
• 2.2.11 酵母诱导条件的摸索
• 2.2.12 酵母发酵上清的浓缩处理
• 2.2.13 生物测定
• 3 实验结果
• 3.1 AaIT序列的优化
• 3.2 AaIT原核非融合表达
• 3.3 AaIT原核融合表达
• 3.4 重组穿梭质粒pPIC6α-AaIT的构建
• 3.5 AaIT在毕赤酵母中的诱导表达
• 3.6 生物活性测定
• 4 分析与讨论
• 4.1 大肠杆菌表达AaIT可行性研究
• 4.1.1 大肠杆菌菌株的选择
• 4.1.2 大肠杆菌Origami（DE3）表达AaIT的诱导条件
• 4.1.3 大肠杆菌系统的局限性
• 4.2 用酵母表达蝎毒素AaIT
• 4.2.1 引物的设计
• 4.2.2 分泌信号肽的应用
• 4.2.3 酵母工程菌的筛选
• 4.2.4 AaIT在毕赤酵母中的诱导表达
• 4.2.5 AaIT在酵母中表达的影响因素
• 4.3 密码子优化对AaIT表达的影响
• 4.4 重组AaIT的生物活性
• 参考文献
• 硕士研究生期间发表论文
• 致谢