雷公藤对1型糖尿病大鼠Foxp3基因表达的作用研究

论文摘要

目的研究Foxp3基因在大鼠1型糖尿病模型中的表达及雷公藤对其表达的影响,以期探讨Foxp3基因表达的变化在1型糖尿病发病机制中的意义。方法将Wistar大鼠随机分成三组:Ⅰ组为正常对照,Ⅱ组为糖尿病组、Ⅲ组为雷公藤组,Ⅱ组、Ⅲ组采用完全福氏佐剂联合小剂量链脲佐菌素（STZ）腹腔注射的方法制备大鼠1型糖尿病模型,成模后Ⅲ组给予雷公藤多甙（GTT）灌胃,1次/d,连续3个月,其中每隔1个月每组各处死一批。处死大鼠后分离血清用间接ELISA法测定自身抗体的水平;取胰腺做HE染色观察其病理变化;淋巴细胞转化试验（MTT法）检测脾单个核细胞增殖活性;提取外周血及脾单个核细胞总RNA,实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time PCR）检测Foxp3 mRNA的表达;应用免疫组织化学技术检测淋巴结和脾组织中Foxp3蛋白的表达,并与对照组进行比较。结果小剂量多次腹腔注射STZ成功制造了大鼠1型糖尿病模型,成模率87.88%。成模后Ⅱ、Ⅲ组血糖均较Ⅰ组明显升高（P＜0.01）,此后3个月一直维持在高水平;胰岛相关自身抗体检测结果显示Ⅱ、Ⅲ组大鼠血清平均自身抗体的水平明显高于Ⅰ组（P＜0.05）;胰腺HE染色示Ⅱ、Ⅲ组大鼠胰腺间质及胰岛中可见以淋巴细胞和单核细胞为主的炎性细胞浸润,Ⅲ组在给药2个月后炎性细胞浸润程度较Ⅱ组减轻,3个月后减轻更加明显;Ⅱ、Ⅲ组单个核细胞增殖活性均较Ⅰ组明显升高（P＜0.01）,用药后3个月中Ⅲ组呈下降趋势,Ⅱ组持续在高水平;Ⅱ、Ⅲ组在成模后1、2、3个月中外周血及脾单个核细胞Foxp3 mRNA水平均较Ⅰ组升高（P＜0.05）,其中,Ⅲ组表达水平较Ⅱ组进一步升高（2、3月后升高明显）,但差别无统计学意义（P＞0.05）。3个月中随着时间的推移,Ⅰ组组间无明显变化,Ⅲ组组间外周血和脾单个核细胞Foxp3 mRNA表达水平呈升高趋势,而Ⅱ组组间呈降低趋势;Foxp3蛋白表达水平Ⅱ、Ⅲ组均普遍高于Ⅰ组（P＜0.05）,Ⅲ组表达水平较Ⅱ组有所升高,但差别无统计学意义（P＞0.05）。结论Foxp3基因表达的变化参与了STZ诱导的大鼠1型糖尿病的发生与发展;上调Foxp3基因的表达是否为雷公藤免疫干预机制之一尚有待进一步研究。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验动物
• 1.1.2 主要仪器设备
• 1.1.3 主要实验试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 大鼠的饲养
• 1.2.2 1型糖尿病大鼠模型的建立
• 1.2.3 间接ELISA法检测胰岛素相关自身抗体水平
• 1.2.4 病理检测
• 1.2.4.1 组织石蜡包埋及切片
• 1.2.4.2 胰腺HE染色
• 1.2.4.3 脾、淋巴结免疫组化
• 1.2.5 脾单个核细胞增殖试验（MTT法）
• 1.2.5.1 脾单个核细胞的分离
• 1.2.5.2 细胞增殖活性检测
• 1.2.6 荧光定量PCR检测Foxp3 mRNA表达
• 1.2.6.1 荧光定量PCR检测方法的原理
• 1.2.6.2 引物的设计与合成
• 1.2.6.3 荧光探针的设计与合成
• 1.2.6.4 分离单个核细胞
• 1.2.6.5 总RNA的提取（Trizol一步法）
• 1.2.6.6 逆转录合成互补DNA（cDNA）
• 1.2.6.7 实时荧光定量PCR反应
• 1.3 统计学分析
• 第二章 结果
• 2.1 大鼠成模率和血糖的检测
• 2.2 血清自身抗体水平检测（ELISA间接法）
• 2.3 大鼠胰腺病理变化的观察
• 2.4 脾单个核细胞增殖活性检测
• 2.5 外周血和脾单个核细胞Foxp3 mRNA的表达
• 2.6 免疫组化染色结果
• 第三章 讨论
• 3.1 腹腔注射STZ可成功构建大鼠1型糖尿病模型
• 3.2 Foxp3表达水平的改变及其在糖尿病发病机制中的意义
• 3.3 雷公藤对1型糖尿病的治疗作用及其与Foxp3的相关性
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 综述的参考文献
• 攻读学位期间的研究成果
• 附录
• 附录1 试剂的配制
• 附录2 大鼠Foxp3cDNA基因片段及相应氨基酸序列
• 致谢