应用噬菌体展示技术筛选兔出血症病毒抗原模拟表位及其ELISA抗体检测方法的建立

论文摘要

兔出血症（Rabbit Hemorrhagic Disease, RHD）是由兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV）引起的家兔的一种高度接触性、致死性传染病,以肝细胞坏死、实质脏器出现淤血及出血性变化、死亡率高等为特点,给养兔业造成巨大的经济损失。噬菌体展示技术通过模拟配体-受体间的特异性结合作用而达到从噬菌体多肽文库中筛选特异性配体的目的。该技术被广泛应用在抗原表位筛选、疾病检测、疫苗研究以及多肽药物筛选等方面。在抗原表位的研究中,主要使用亲和筛选的方法,通过三到四轮亲和筛选,有效富集特异性噬菌体克隆,获得抗原模拟表位。本研究为获得抗原RHDV的抗原表位,使用实验室构建的抗RHDV单抗A3c作为固相筛选分子,用噬菌体展示技术进行亲和筛选。为获得新型RHDV检测方法,在亲和筛选的基础上,用筛选得到的噬菌体克隆作为模拟抗原,建立了检测兔血清中RHDV抗体的间接ELISA方法。抗原表位的研究为RHDV分子生物学的进一步研究和新型疫苗的探索提供基础,而间接ELISA方法的建立为兔场免疫效果的评价和流行病学调查提供了有利工具。具体试验内容和结果如下：1. RHDV抗原模拟表位的筛选。复苏实验室保存的RHDV单抗A3c杂交瘤细胞系,并制备腹水型单抗。单抗纯化后测定其纯度、浓度、效价及亲和常数。用高活性、高纯度的单抗作为固相筛选分子,应用噬菌体展示技术进行亲和筛选,对筛选的噬菌体克隆进行鉴定并测序,获得与抗原高度同源的序列,即抗原的表位。结果表明,制备的单抗经纯化后纯度高于80%,ELISA效价为1：81920,亲和常数为3.5×107,具有较高的纯度和活性,可以用作固相亲和筛选。经过三轮亲和筛选,有效富集了特异性噬菌体克隆。用夹心ELISA方法鉴定,结果表明25个噬菌体克隆中19个为阳性克隆。竞争ELISA方法进一步验证了这些克隆与单抗的结合具有特异性。接下来对阳性噬菌体克隆进行测序,结果表明,获得了与抗原高度同源的序列GTDDMDPGTTAA,即抗原的模拟表位。其中,氨基酸基序DXXDP为表位中的核心氨基酸。2.应用亲和筛选得到的阳性噬菌体克隆K1作为模拟抗原,建立检测兔出血症病毒抗体的间接ELISA方法。本研究对ELISA的各个反应条件进行优化,测定该方法的特异性、灵敏性、重复性以及包被的酶标板的保存期,并用该方法检测了100份兔血清中抗体水平。实验结果表明,该方法中噬菌体的最佳包被浓度为1.56×107pfu/ml,血清的最佳稀释度为1：200,5%BSA为最适封闭液,酶标二抗的最佳稀释度为1：5000,封闭液的封闭时间、抗原抗体作用时间、酶标二抗作用时间以及底物的显色时间分别为90min、30min、30min和10min。应用该方法检测100份兔血清中的RHDV抗体水平,其中阳性样品数为86（86%）,而用实验室建立的RHDV VP60蛋白间接ELISA方法检测,阳性样品数为73（73%）。比较两种检测方法,符合率为85%。因此,该ELISA方法特异性好、灵敏度高、重复性好、操作简便,适用于临床推广。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 縮略词表（Abbreviation）
• 第一部分 文献综述
• 1 兔出血症
• 1.1 兔出血症的流行病学、临床症状及病理变化
• 1.2 病原分子生物学
• 1.3 疫苗的研究现状
• 2 噬菌体展示及随机肽库技术
• 2.1 噬菌体展示技术的原理
• 2.2 噬菌体展示系统分类
• 2.3 噬菌体随机肽库
• 2.4 噬菌体展示技术的应用
• 参考文献
• 第二部分 实验部分
• 第一章 应用噬菌体展示技术筛选RHDV抗原模拟表位
• 摘要
• ABSTRACT
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 生物材料及试剂盒
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.1.4 实验动物
• 1.2 方法
• 1.2.1 兔出血症病毒单克隆抗体的制备与纯化
• 1.2.2 噬菌体展示肽库的亲和筛选
• 2 结果
• 2.1 兔出血症病毒单克隆抗体的制备与纯化
• 2.1.1 单抗A3c的制备
• 2.1.2 单抗A3C亚型的鉴定
• 2.1.3 纯化后单抗A3C的纯度的鉴定
• 2.1.4 纯化后单抗A3C浓度的测定
• 2.1.5 单抗A3C效价的测定
• 2.1.6 单抗A3C亲和常数的测定
• 2.2 噬菌体展示肽库的亲和筛选
• 2.2.1 亲和筛选结果
• 2.2.2 三轮洗脱液中噬菌体与靶分子单抗A3c亲和活力
• 2.2.3 噬菌体单克隆ELISA鉴定
• 2.2.4 噬菌体单链DNA序列分析
• 2.2.5 噬菌体克隆的特异性研究
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二章 应用噬菌体克隆建立检测兔出血症病毒抗体的间接ELISA方法
• 摘要
• ABSTRACT
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试剂和血清
• 1.1.2 仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 应用噬菌体克隆建立ELISA方法的可行性
• 1.2.2 间接ELISA最佳反应条件的确定
• 1.2.3 间接ELISA操作程序的确定和结果判定
• 1.2.4 阻断试验
• 1.2.5 敏感性试验
• 1.2.6 保存期试验
• 1.2.7 重复性试验
• 1.2.8 临床应用
• 2 结果
• 2.1 应用噬菌体克隆建立ELISA方法的可行性
• 2.2 间接ELISA最佳反应条件的确定
• 2.3 间接ELISA操作程序的确定和结果判定
• 2.4 阻断试验
• 2.5 敏感性试验
• 2.6 保存期试验
• 2.7 重复性试验
• 2.8 临床应用
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 附录：主要试剂的配制
• 致谢