HIF-1α与MVD在前列腺疾病组织中的表达及其临床意义

论文摘要

研究背景：自Thomlisom和Gray发现实质性肿瘤内存在低氧浓度区域以来,基础实验和临床研究中已有许多证据表明,肿瘤内的缺氧是由于肿瘤内异常贫乏的血管引起,缺氧的存在不仅是肿瘤生长的结果,而且使肿瘤更具有侵袭性,容易发生远处转移。随着分子生物学等技术的发展,人们对乏氧导致的肿瘤细胞适应性变化及相关的一系列病理生理过程有了进一步的认识。目前认为,因乏氧引起的肿瘤对自身侵袭增强的机制主要有以下几个方面：①乏氧能特异性抑制肿瘤细胞S期DNA复制的启动,当处于S期的细胞再氧合时,引起DNA过度复制,其结果一方面引起放射抗拒基因的扩增而使肿瘤对放射治疗的抗拒性增加,另一方面引起肿瘤细胞染色体的畸变和重组,导致肿瘤的特异性增加。②肿瘤内乏氧一再氧合能产生氧来源的自由基,其中氢氧自由基能增加基因的不稳定性,造成基因突变,使肿瘤细胞的基因变成更具有侵袭性的表型。③乏氧能使肿瘤细胞的一些基因和蛋白的合成或表达增加,包括氧调节蛋白（oxygen regulated proteins,ORP,如血红素加氧酶和糖酵解酶等）、血管内皮生长因子（VEGF）、促红细胞生成素（EPO）、p53和血小板源性生长因子-β（PDGF-β）等。这些酶或因子的变化使肿瘤在适应缺氧微环境的同时,引起肿瘤自身的侵袭性增加和对治疗的抗拒。1992年Semenza和Wang等人将人肝癌细胞株Hep3B和HepG2细胞经1%低氧处理后,发现细胞内红细胞生成素mRNA（EPO mRNA）可增加50倍,而且经低氧处理过的细胞,其细胞核提取物也具有促进EPO基因转录的作用,但预先给予蛋白合成抑制剂能阻断缺氧对基因表达的诱导作用,接着对该细胞株的核提取物进行电泳位移分析,发现了一种可与EPO基因增强子特异性结合的蛋白,该蛋白能激活多种缺氧反应基因的表达,故被命名为缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1,HIF-1）。1993年,Wang等分别从培养的Hep3B和HeLaS3细胞中提纯了HIF-1,并对其性质进行了研究,提出HIF-1是一种基因表达的生理性调节因子。后来学者们通过进一步的研究发现缺氧诱导因子-1是一种介导哺乳动物细胞低氧反应的核转录因子,缺氧条件下广泛表达于哺乳动物的各种组织细胞,促进机体和细胞对于低氧的适应过程,缺氧诱导因子表达的增加还与肿瘤发生、发展密切相关,它不仅在肿瘤细胞及其转移细胞中过度表达,而且能诱导肿瘤组织中异常基因的表达,同时对肿瘤细胞的生长、肿瘤新生血管的形成密切相关。HIF-1由α、β亚基以异源二聚体形式组成,其中HIF-1α是唯一氧调节亚基,决定HIF-1的活性。当氧浓度过低时,HIF-1α蛋白表达增加,并通过调控多种靶基因的表达,产生一系列的生理效应适应相对低氧环境,参与肿瘤生长、浸润和转移。目前已发现在多种心恶性肿瘤中检测到HIF-lα蛋白的过度表达。血管形成在实体肿瘤生长及转移也中起着极为重要的作用。血管前期肿瘤体积较小,血管形成后可为肿瘤提供营养,同时,新形成的血管内皮不完整,为肿瘤细胞进入血液循环,形成转移提供了通道。肿瘤的血管形成过程复杂,大致分为以下6个步骤：①肿瘤组织产生血管形成诱导因子；②内皮细胞在血管形成诱导因子作用下出现形态结构变化；③内皮细胞与肿瘤细胞释放蛋白酶,降解毛细血管基底膜和周围的细胞外基质,引起细胞外基质重塑；④毛细血管后微静脉的内皮细胞迁徙,形成血管新芽；⑤内皮细胞增殖,血管新芽不断延伸；⑥肿瘤血管分化和成型。通过阻断上述步骤中的几个主要环节,可以抑制肿瘤血管形成,影响肿瘤生长与转移。因此针对HIF-1α的抗血管形成研究,可为目前恶性肿瘤的治疗提供新的策略,具有一定临床意义。研究目的：为了探讨HIF-1α与微血管密度（microvessel density,MVD）在人前列腺疾病发生过程中所起的作用及临床意义,运用免疫组化的方法,通过对前列腺癌（PC）、高级别前列腺上皮内瘤（HGPIN）.良性前列腺增生（BPH）及正常前列腺（NP）等不同组织进行HIF-1α和CD34免疫组化染色,分别观察其在前列腺疾病组织中分布特点。研究方法：收集广州军区广州总医院2006年9月-2010年7月常规前列腺穿刺和手术标本,选取HIF-1α和CD34作为标记物,运用免疫组化的方法检测前列腺疾病组织HIF-1α与MVD的表达。其中前列腺癌患者30例,年龄55-82岁,平均71.13±6.32岁。所有病例术前未接受过甾体抗炎药物治疗、放疗及化疗。肿瘤病理分级根据Gleason评分系统可分为：Gleason2-4分化良好、Gleason5-6分化中等和Gleason7-10分化差,分别为7、9、14例。临床分期根据美国癌症分期联合委员会（AJCC）2002分期系统：Ⅰ+Ⅱ期11例,Ⅲ+Ⅳ期19例。30例前列腺癌患者中有远处转移者15例。穿刺标本中高级别前列腺上皮内瘤10例,年龄55-76岁,平均67.10±7.06,良性前列腺增生患者15例,年龄58-76岁,平均年龄68.80±5.13岁。正常前列腺组10例,年龄20-35岁,平均26±5.121岁,正常前列腺组由南方医科大学人体解剖学教研室提供,从耻骨后取出完整前列腺、修剪后测其重量为12-20 g之间,立即置于-80℃超低温液氮罐中保存,实验时缓慢解冻,取其背侧部分及尿道周围腺体。所有标本取出后经4%中性甲醛固定,常规石蜡包埋,4um连续切片3张。1张作苏木精-伊红染色,以确定诊断,另2张分别做HIF-1α和CD34免疫组化染色。已知染色阳性的大肠癌组织切片作为阳性对照,PBS代替一抗作为阴性对照。HIF-1α阳性染色主要表现为细胞核或细胞核及部分细胞浆内呈现棕黄色颗粒,判断标准：组织内阳性细胞数占细胞总数的百分比。CD34染色血管内皮细胞,以组织内出现棕黄色血管内皮细胞代表一条单独的微血管。先在低倍镜下选择高血管密度区域,然后在高倍镜下选择3个视野,每个视野计数被CD34染成棕黄色的血管数,取平均值作为该组织的MVD值。比较前列腺癌、高级别前列腺上皮内瘤、良性前列腺增生及正常前列腺组织标本中表达结果的差异,并与临床进展因素进行综合分析。数据统计在SPSS13.0统计软件上进行。计量资料先行方差齐性检验,正常组和前列腺疾病组间多个样本均数间的多重比较采用单因素方差分析（One-WayANOVA）,两组间差异应用两样本t检验（two-sample t-test）。HIF-1α、MVD两者间相关性分析采用Peason积矩相关分析。P<0.05为有统计学意义。结果：HIF-1α在正常前列腺表达呈阴性,而在前列腺癌、高级别前列腺上皮内瘤、良性前列腺增生三组中阳性细胞百分比分别为73.13±8.57、64.53±14.49、22.93±12.58；HIF-1α在前列腺癌高、中、低分化细胞病理学分级三组中阳性细胞百分比为62.34±6.35、70.93±2.88、79.95±4.90,HIF-1α在前列腺癌临床分期Ⅰ+Ⅱ、Ⅲ+Ⅳ两组阳性细胞百分比为65.31±6.43、77.67±6.02,HIF-1α在前列腺癌有无远处转移组织中阳性细胞百分比为79.56±4.97、66.71±6.25；MVD在前列腺癌、高级别前列腺上皮内瘤、良性前列腺增生及正常前列腺四组中计数分别为62.13±9.22、35.20±9.69、23.53±7.60、16.00±5.16；MVD在前列腺癌高、中、低分化细胞病理学分级三组中计数分别为50.57±4.58、60.44±4.19、69.00±6.68,MVD在前列腺癌临床分期Ⅰ+Ⅱ、Ⅲ+Ⅳ两组计数分别为53.82±6.08、66.95±7.06,MVD在前列腺癌有无远处转移组织中计数分别为67.67±7.83、56.60±7.03；以上各组间差异均具有统计学意义（P<0.05）,且前列腺癌组织中HIF-1α的表达和MVD计数之间呈正相关（r=0.835,P<0.01）。结论：1.HIF-1α和MVD在前列腺疾病的发生发展中可能具有重要意义,由正常前列腺组织向前列腺增生、高级别前列腺上皮内瘤和前列腺癌的发展过程中HIF-1α与MVD经历了由低表达到高表达的过程。2.HIF-1α与MVD过度表达和前列腺癌的临床进展因素密切相关,有可能作为预测肿瘤预后的参考指标。3.过度表达的HIF-1α是前列腺癌形成中的早期改变,其水平的增高可趋化肿瘤向恶性方向发展,HIF-1α有可能成为治疗前列腺癌潜在靶点。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料与方法
• 1.1 标本来源及临床资料
• 1.2 试剂和仪器
• 1.3 实验方法
• 1.4 统计学处理
• 结果
• 2.1 HIF-1α在PC、HGPIN、BPH及NP组织中的表达特点
• 2.2 MVD在PC、HGPIN、BPH及NP组织中的表达特点
• 2.3 PC中HIF-1α、MVD与临床病理的关系
• 2.4 PC中HIF-1α、MVD的关系
• 讨论
• 3.1 HIF-1α的发现和MVD计数技术的发展
• 3.2 HIF-1α的结构、功能与表达的调控
• 3.3 MVD与肿瘤的相关性
• 3.4 HIF-1与肿瘤MVD的关系
• 3.5 前列腺肿瘤组织中HIF-1α、MVD表达特点
• 3.6 HFI-la与肿瘤的治疗
• 3.7 展望
• 参考文献
• 小结
• 综述
• 参考文献
• 在读期间撰写论文情况
• 缩略词索引表
• 致谢
• 统计学证明