论文摘要
目的:内毒素休克是严重危害人类健康的病理过程,死亡率极高,一直是医学研究的重点课题。血管调节机制紊乱是内毒素休克特征性病理改变之一,主要表现为内毒素休克发生早期主动脉压下降、肺动脉压升高。在内毒素休的发病过程中氧自由基（oxygen-derived free radicals,OFR）的生成增多与血管调节机制紊乱密切相关,是造成内毒素休克患者持续性低血压的重要原因之一。其中超氧阴离子（superoxide anion, ）能衍生多种其他氧化剂、启动过氧化损伤,还可以与同时增多的一氧化氮（nitric oxide,NO）通过快速非酶促化学反应生成过氧亚硝基阴离子（ONOO-）。ONOO-的反应性极强,可与机体绝大多数成分反应,可剂量依赖性导致离体胸主动脉收缩反应进行性低下,表明由NO和衍生的ONOO-可能是内毒素休克发病过程中引起动脉反应性异常变化的关键因素。八肽胆囊收缩素（cholecystokinin octapeptide,CCK-8）是一种小分子脑肠肽,通过其受体发挥调节作用,其受体属于G蛋白藕联受体,根据亲和力以及生物学功能的不同,分为A、B两种亚型。CCK-8具有明确的抗内毒素休克作用,其详细分子作用机制尚不十分清楚。CCK-8可抑制内毒素孵育的培养肺动脉内皮细胞生成ONOO-,而对外源性ONOO-没有直接清除作用,表明CCK-8作用的靶分子可能是血管一氧化氮合酶（NOS）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）或的生成体系。本室已有研究表明CCK-8对LPS诱导大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞（thoracic aortic smooth muscle cells,TASMCs）SOD活性变化有调节作用,本实验在此基础上观察CCK-8对LPS诱导TASMCs CuZn-SOD基因表达的影响,进一步研究CCK-8缓解内毒素休克血管动力学紊乱的分子机制。方法:选用雄性、健康Wistar大鼠（120±20g）,无菌条件下分离大鼠胸主动脉,用贴块法培养TASMCs,传代至对数生长期（实验用5～8代）,调整细胞密度为每瓶1×107,加入无血清DMEM培养液以及不同处理因素,分组如下:1、LPS诱导TASMCs CuZn-SOD mRNA表达:以生理盐水为对照组,用0.1mg/L LPS孵育细胞2h、4h和8h,0.01mg/L、0.1mg/L、1mg/L LPS分别孵育细胞4h,测定CuZn-SOD mRNA表达变化。2、CCK-8对LPS诱导TASMCs CuZn-SOD mRNA表达的影响:以生理盐水为对照组,经10-8mol/L CCK-8,0.1mg/L LPS和10-6、10-8、10-10mol/L CCK-8+LPS分别孵育细胞4h,测定CuZn-SOD mRNA表达变化。3、CCK-8对LPS诱导TASMCs CuZn-SOD基因表达影响的受体机制:以生理盐水为对照组,10-8mol/L CCK-8、0.1mg/L LPS、CCK-8+LPS和10-5mol/L CR-1409+CCK-8+LPS、10-5mol/L CR-2945+CCK-8+LPS分别分别孵育细胞4h,测定CuZn-SOD mRNA表达变化,其中CR-1409、CR-2945分别为CCK-AR和CCK-BR特异性拮抗剂。用RT-PCR方法检测CuZn-SOD基因表达,用江苏捷达凝胶分析软件对电泳谱带进行半定量分析,用CuZn-SOD与β-actin的吸光度比值代表CuZn-SOD mRNA相对表达水平。数据用x±s表示,用SPSS统计分析软件进行统计学分析,各组均数的比较行单因素方差分析（ANOVA）,用最小显著差法（LSD）作两两比较,P<0.05为有显著性差异。结果:1、LPS对TASMCs CuZn-SOD基因表达的影响（1）LPS与CuZn-SOD基因表达的时效关系对照组TASMCs存在CuZn-SOD mRNA低水平表达;0.1mg/L LPS孵育细胞2h CuZn-SOD mRNA表达呈现增高趋势,LPS孵育细胞4h CuZn-SOD mRNA表达增高与对照组相比有明显差异（P<0.01）,LPS孵育细胞8h CuZn-SOD mRNA持续高表达（P<0.05）。（2）LPS与CuZn-SOD基因表达的量效关系对照组TASMCs存在CuZn-SOD mRNA低水平表达;0.01 mg/L、0.1 mg/L及1mg/L LPS孵育细胞4h CuZn-SOD mRNA表达均增高,0.1mg/L LPS组与对照组相比有明显差异（P<0.01）,1mg/L LPS组CuZn-SOD mRNA持续高表达（P<0.05）。2、CCK-8对LPS诱导TASMCs CuZn-SOD mRNA表达的影响CCK-8预先处理TASMCs 30 min后再加入LPS,则LPS对TASMCs CuZn-SOD mRNA表达的诱导作用可部分受抑,且此抑制效应呈剂量依赖性,与LPS组相比有显著性差异（P<0.01）;CCK-8单独孵育也可抑制CuZn-SOD mRNA表达,与对照组相比有显著性差异（P<0.01）。3、CCK-8对LPS诱导TASMCs CuZn-SOD基因表达影响的受体机制预先用CR-1409、CR-2945处理TASMCs 10 min后,再分别加入LPS和CCK-8。CR-1409+CCK-8+LPS、CR-2945+CCK-8+LPS两组CuZn- SOD mRNA表达均高于CCK-8+LPS组（P<0.01）,但仍低于LPS组（P<0.05）,其中CR-2945的拮抗作用比CR-1409稍明显。结论:在生理状态下TASMCs CuZn-SOD基因有基础表达;LPS可诱导TASMCs CuZn-SOD基因表达增加;CCK-8可抑制TASMCs CuZn-SOD基因基础表达,下调LPS对TASMCs CuZn-SOD基因表达的诱导作用,CCK-8通过其受体发挥上述调节作用,其中CCK-BR较CCK-AR作用稍大。
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