赤子爱胜蚓体腔液粗提物抗肿瘤机制研究

论文摘要

体腔液是蚯蚓体内重要的免疫屏障,含有多种免疫细胞和生物活性分子参与蚯蚓体内免疫防御反应。蚯蚓体腔液具有抑菌、蛋白裂解酶、溶血、凝血、细胞毒及促有丝分裂等多种生物活性。但对体腔液核酸酶活性却未见报道。近年来对蚯蚓抗肿瘤研究成为热点,主要集中在丝氨酸蛋白酶发挥抗肿瘤活性方面。本课题通过制备高核酸酶活性的体腔液粗提物,研究该组分抗肿瘤机制以进一步揭示核酸酶在免疫防御中的重要作用。本课题以赤子爱胜蚓体腔液为原料,经硫酸铵梯度盐析,低温丙酮沉淀等步骤分离得到具有高核酸酶活性的粗提物组分。通过琼脂糖凝胶电泳和RNA甲醛变性凝胶电泳检测粗提物核酸酶活性;纤维蛋白平板法检测纤溶酶活性;兔红细胞悬液检测溶血和凝集活性。通过MTT法和SRB法分析体腔液粗提物对肿瘤细胞株(Siha, SW480, Colo205和PC12)及正常二倍体细胞株(Cos7)的增殖抑制作用。倒置光学显微镜和Hoechst33258荧光染色观察受试细胞形态学改变; DNA Ladder凝胶电泳和单细胞凝胶电分析受试细胞DNA损伤情况;流式细胞术分析受试细胞凋亡率及细胞凋亡停滞周期。通过协同作用实验,肿瘤细胞侵袭和转移实验,进一步确定核酸酶成分抗肿瘤机制。活性测定表明蚯蚓体腔液粗提物具有纤维蛋白溶解酶和纤维蛋白溶酶原活性,丧失溶血和凝集活性;有极高的核酸酶活性,对质粒DNA、肿瘤细胞基因组DNA和面包酵母RNA均有降解作用。体外抗肿瘤活性显示,粗提物对肿瘤细胞的抑制作用在一定范围内具有量效和时效关系,且不同癌细胞对该成分细胞毒活性的敏感度有差异。受试细胞在形态学上显示典型的凋亡改变,DNA ladder和单细胞琼脂糖凝胶电泳分析表明,细胞染色质的损伤程度呈时间依赖性改变,流式细胞检测到凋亡细胞的存在,认为粗提物对受试细胞的增殖抑制作用主要是将细胞阻滞在S期。PMSF,热变性和蛋白酶K处理使粗提物的抗肿瘤活性降低,而胰酶处理对活性没有影响。蚯蚓核酸酶纯品抗肿瘤活性研究表明,RNase能抑制受试肿瘤细胞增殖;DNase对肿瘤细胞增殖无显著改变,却可显著增强无DNase活性层析组分和顺铂的抗肿瘤活性,并显示出抑制肿瘤细胞侵袭和转移的活性。体腔液粗提物通过如下机制发挥抗肿瘤活性:(1)丝氨酸蛋白酶能水解肿瘤细胞中某些结构蛋白,破坏肿瘤细胞结构完整性,抑制肿瘤细胞的生长;(2)核糖核酸酶通过某种受体介导进入肿瘤细胞,降解rRNA,抑制蛋白合成,导致肿瘤细胞凋亡;(3)脱氧核糖核酸酶通过细胞缺损进入细胞,协同核内caspases激活的DNase(CAD),降解核内遗传物质,使细胞DNA合成受阻,停滞于S期;(4)脱氧核糖核酸酶降解癌细胞表面由DNA组成的网状物或细胞衣,降低癌细胞聚集性,减弱癌细胞侵袭和转移能力,同时增加抗肿瘤成分与肿瘤细胞的有效接触面积,增强抑制效应。蚯蚓体腔液核酸酶参与粗提物抗肿瘤作用,推测核酸酶是蚯蚓固有免疫的防御分子之一。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 赤子爱胜蚓体腔液粗提物制备工艺
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 第二部分 赤子爱胜蚓体腔液粗提物活性测定方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 第三部分 赤子爱胜蚓体腔液粗提物抗肿瘤活性研究
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 第四部分 赤子爱胜蚓体腔液核酸酶抗肿瘤机制初探
• 4.1 材料
• 4.2 方法
• 4.3 结果
• 4.4 讨论
• 第五部分 存在的问题及进一步实验方案的设计
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 个人简介
• 致谢