人的类RecD解旋酶Pif1通过抑制端粒酶活性调控端粒延伸

论文摘要

端粒是真核生物线状染色体的末端结构,由端粒DNA和其结合蛋白组成。它在维持基因组的稳定、防止染色体DNA末端融合和降解中起着重要的作用,并与癌症、衰老密切相关。端粒DNA重复序列的延伸是由特化的反转录酶即端粒酶完成的。端粒酶的核心组分是由具有催化活性的蛋白质亚基(hTERT)和RNA亚基(hTR)组成,hTR为合成端粒DNA重复序列提供模板。以前的研究发现芽殖酵母Pif1解旋酶通过抑制端粒酶途径来抑制端粒DNA的加长。端粒DNA复制的基本机制从酵母到人都高度保守,而类Pif1基因在多种生物中都广泛存在。因而,本研究的主要目的是鉴定人Pif1蛋白,是否也参与了端粒DNA的复制和维持。本工作首先克隆了人Pif1的cDNA。一级结构及生化分析表明,人Pif1蛋白是大肠杆菌RecD潜在的同源蛋白;具有依赖于ATP的5’至3’的DNA解旋酶活性。在端粒酶阳性的HT1080细胞中过表达野生型hPif1蛋白可导致细胞端粒DNA缩短,抑制hPif1过表达可使端粒DNA长度恢复。人Pif1对端粒DNA长度的影响需要其ATPase/解旋酶活性,因为丧失ATPase/解旋酶活性的突变体过表达不影响端粒DNA的长度。在端粒酶阴性的GM487细胞中过表达hPif1不影响端粒变化,提示hPif1蛋白对端粒DNA的效应是通过端粒酶通路介导的。体外生化实验还显示,重组Pif1蛋白可通过降低端粒酶的进行性从而直接抑制端粒酶的活性,而且,hPif1解旋酶能够解开DNA/RNA杂合双螺旋。染色质免疫沉淀还证实hPif1结合在端粒DNA上。基于这些实验结果,我们推测hPif1通过把端粒酶RNA从端粒DNA上解离下来而抑制端粒酶介导端粒DNA的加长。类RecD解旋酶在生物进化过程中已获得新功能。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩写
• 图表目录
• 一、引言
• 1. 端粒和端粒酶的研究历史
• 2. 端粒结合蛋白与端粒长度调控
• 2.1 双链结合蛋白
• 2.1.1 TRF1 及其调控蛋白
• 2.1.1.1 TRF1 （telomeric-repeat binding factor 1）
• 2.1.1.2 TRF1 的调控蛋白
• 2.1.1.2.1 Pin2 （NIMA-interacting protein 2）
• 2.1.1.2.2 端锚ADP核糖聚合酶Tankyrase （TRF1 interacting ankyrin related ADP ribose polymerase）
• 2.1.1.2.3 TIN2 (TRF1-interacting nuclear factor2
• 2.1.1.2.4 PinX1 (Pin2/TRF1-interacting protein
• 2.1.2 TRF2 及有关端粒结合蛋白
• 2.1.2.1 TRF2 （telomeric-repeat binding factor 2）
• 2.1.2.2 调节TRF2 的蛋白
• 2.1.2.2.1 hRAP1 （human repressor-activator protein 1）
• 2.1.2.2.2 BLM和WRN
• 2.1.2.2.3 核内不均一核糖核蛋白
• 2.1.2.2.4 Rad50/Mre11/Nbs1
• 2.1.2.2.5 DNA依赖的蛋白激酶和Ku蛋白
• 2. 2 单链结合蛋白
• 2. 2. 1 端粒末端保护蛋白 1
• 2. 2. 2 其它物种的端粒单链DNA结合蛋白
• 3. 端粒酶及其活性调控
• 3.1 表达调控
• 3.2 活性调控
• 3.2.1 hTERT与 14-3-3
• 3.2.2 hTERT 与HSP90
• 3.2.3 hTERT 与Ku
• 4. 解旋酶与端粒复制调控
• 5. Pif1 解旋酶亚家族
• 二、 材料与方法
• 1. 人Pif1 cDNA的克隆与亚克隆
• 2. 制备并纯化抗体
• 3. hPif1 融合蛋白在酵母中的表达和纯化
• K234AΔN'>3.1 构建酵母表达载体pEG（KT）-hPif1ΔN及pEG（KT）-hPif1^K234AΔN
• 3.2 GST融合蛋白在酵母表达系统中的小量纯化
• 4. DNA/RNA解旋酶活性测试
• 5. 稳定表达株筛选
• 5.1 转染用的质粒的制备
• 5.2 磷酸钙法转染细胞
• 5.3 筛选稳定转染株
• 6. 可诱导的基因表达系统
• 7. 细胞传代培养
• 8. 免疫沉淀
• 9. MTT比色法测定细胞生长速率
• 10. FACS法细胞凋亡分析
• 11. Northern分析
• 11.1 样品总 RNA 的抽提
• + mRNA的分离'>11.2 polyA⁺mRNA的分离
• 11.3 Northern blot 杂交
• 12. 端粒DNA印记杂交及端粒长度测定
• 12.1 抽提基因组DNA
• 12.2 限制性酶切、消化基因组DNA与电泳分离
• 12.3 Southern转移
• 12.4 预杂交和杂交
• 12.5 脉冲场电泳-端粒Southern印记
• 13. 利用GFP融合蛋白进行细胞定位研究
• 13.1 基因转染及细胞铺片的制备
• 13.2 hPif1 在转染细胞中表达的检测
• 14. 细胞免疫荧光
• 15. 染色质免疫沉淀（ChIP）
• 16. 细胞核蛋白的制备
• 17. 体内泛素化试验
• 18. Beta-半乳糖苷酶检测系统
• 19. 基于端粒重复序列扩增法端粒酶体外抑制试验
• 20. 人端粒酶体外重建
• 21. 端粒酶直接测活试验
• 22. hPif1 蛋白的种系进化分析
• 23. 引物与寡核苷酸序列
• 三、结果
• 1. 人Pif1 全长cDNA的克隆
• 2. 人Pif1 蛋白是一种的大肠杆菌RecD同源蛋白
• 3. 人Pif1 蛋白的四种多克隆抗体的制备
• 4. 人Pif1 基因在端粒酶阳性细胞株中表达,但在端粒酶阴性细胞无表达
• 5. 人Pif1 蛋白具有 5’至 3’的DNA解旋酶活性
• 6. 细胞中Pif1 蛋白水平受泛素介导的蛋白质降解系统调控
• 7. 过表达hPif1 不影响细胞的生长
• 8. 过表达有ATP酶/解旋酶活性的hPif1 导致端粒的缩短
• 9. 抑制hPif1 的表达可恢复端粒的长度
• 10. hPif1 在体内通过抑制端粒酶通路抑制端粒的延伸
• 11. hPif1 在体外抑制端粒酶的活性
• 12. 人Pif1 蛋白在体外降低端粒酶的进行性 （与周波合作的工作）
• 13. 人Pif1 蛋白具有RNA/DNA解旋酶活性
• 14. 在体内和体外,hPif1 蛋白与端粒DNA结合
• 四、讨论
• 1. 人Pif1 研究工作的总结
• 2. Pif1 亚家族与RecD亚家族
• 3. 真核生物的RecBCD同源物的探寻
• 4. 人Pif1 蛋白与酵母Pif1 蛋白
• 5.Pif1 解旋酶亚家族成员大多参与端粒复制调控
• 6.hPif1 抑制端粒酶活性的分子机理
• 7.端粒酶活性调控的进展
• 8.解旋酶参与端粒酶活性调控
• 9.人Pif1 基因与人类疾病
• 10. 展望
• 五、 参考文献
• 六、 发表研究论文
• 七、 在读期间申请的专利
• 八、 参加国内国际会议
• 九、 获奖
• 十、 致谢