论文题目: 西瓜枯萎病R基因同源序列的克隆与分析
论文类型: 硕士论文
论文专业: 蔬菜学
作者: 郭绍贵
导师: 陈学好,许勇
关键词: 西瓜,枯萎病,抗病基因类似物,同源序列
文献来源: 扬州大学
发表年度: 2005
论文摘要: 本实验采用RGA（Resistance gene analogs）策略,根据已经克隆的甜瓜抗枯萎病基因Fom-2和番茄抗枯萎病基因I2C以及黄瓜抗病基因同源序列设计了22条上游引物和17条下游引物,组成165对引物组合,用PCR方法对西瓜基因组DNA进行抗枯萎病基因相关同源序列的筛选。86对引物组合在抗枯萎病亲本PI296341和感病亲本97103之间扩增出多态性,多态性比例为52%。其中引物组合SF2/SR10扩增出的约700bp的多态性片段RGA210-700a和SF12/SR5扩增出的约500bp的多态性片段RGA125.500a与西瓜Fom-1基因连锁,分别位于Fom=1基因的两翼,遗传距离分别为25cM和27cM。引物组合SF17/SR14、SF17/SR5、SF18/SR14和SF18/SR5在双亲间的扩增结果没有多态性,但仅扩增出一条单一的条带,大小与在甜瓜Fom-2基因上模拟PCR得到的片段完全一致。共20条目标片段被成功克隆测序,将克隆到的抗病基因同源序列进一步确认后,登录到GenBank。聚类分析将20条序列分为3组,除175S4n外,其他序列所编码的氨基酸序列均含有NBS类抗病基因的P-loop、Kinase2以及Kinase3a等3个保守区域,并与已经克隆的植物抗病基因特别是抗枯萎病基因有较高的同源性。其中7条RGA序列具有完整的ORF,不含有终止密码子,可以通读a从携带Fom-1和Fom-2基因的西瓜种质PI296341上获得的RGA序列1714R3和175R1所编码的氨基酸序列与甜瓜抗枯萎病基因Fore-2同源性高达62.3%和72.5%,并含有P-loop、Kinase2和Kinase3a等3个保守结构域,而且不含有终止密码子,这两条序列对于西瓜抗病枯萎病基因的定位与克隆具有重要的价值。可以根据分别从抗病亲本和感病亲本上获得的RGA序列之间的碱基差异位点设计特异引物,获得与抗病基因紧密连锁的分子标记,从而应用于MAS,加速育种进程。
论文目录:
中文摘要
Abstract
缩略词
引言
1 国内外研究进展
1．1 西瓜枯萎病抗性研究进展
1．1．1 枯萎病菌生理小种的研究
1．1．2 抗性遗传研究
1．1．3 分子生物学研究进展
1．2 植物抗病分子机制
1．3 植物抗病基因研究进展
1．3．1 植物中已克隆的抗病基因
1．3．2 抗病基因的保守区
1．3．2．1 亮氨酸拉链(leucine zipper，LZ)
1．3．2．2 TIR区域
1．3．2．3 核苷酸结合位点(nucleotide binding site，NBS)
1．3．2．4 富含亮氮酸区域(leucine rich repeats，LRR)
1．3．2．5 丝氨酸／苏氨酸蛋白质激酶(PK)
1．3．3 抗病基因的分类
1．4 植物R基因同源序列研究进展
1．4．1 植物基因组中R基因及其同源序列的分布
1．4．2 R基因及其同源序列在基因组中的存在形式
1．4．3 R基因及其同源序列的演化
1．4．4 RGAs与R基因的关系
1．5 葫芦科作物RGAs进展
1．6 基于同源序列的候选基因法
1．6．6．1 同源序列候选基因法的原理
1．6．6．2 同源序列候选基因法的关键技术环节
1．6．6．3 同源序列候选基因法在分离植物基因中的应用
1．6．6．4 同源序列候选基因法的优越性
1．6．6．5 同源序列候选基因法的局限性
1．6．6．6 同源序列候选基因法的研究展望
2 研究方案和技术路线
2．1 研究方案
2．2 研究内容
2．3 技术路线
3 试验材料与方法
3．1 供试亲本和群体
3．2 西瓜RILs幼苗培养
3．3 西瓜枯萎病菌的培养和接种
3．4 病情鉴定和调查
3．4．1 病情分级标准
3．4．2 病情统计方法
3．5 基因组DNA的提取和纯度检测
3．5．1 提取方法
3．5．2 提取DNA的质量检测
3．6 RGA标记的筛选及目标片段的克隆
3．6．1 RGA引物的设计
3．6．1．1 其他植物抗枯萎病基因及其同源序列的检索
3．6．1．2 RGA简并引物的设计
3．6．2 RGA标记的筛选
3．6．2．1 RGA反应体系
3．6．2．2 RGA反应程序
3．6．2．3 聚丙烯酰胺凝胶电泳
3．6．2．4 RILs群体RGA标记的分离检测
3．6．2．5 RILs群体RGA标记的数据收集与编码
3．6．2．6 连锁关系分析
3．6．3 目标片段的回收与连接
3．6．3．1 回收目标片段
3．6．3．2 目标片段与载体的连接
3．6．4 目标片段的克隆
3．6．4．1 重组质粒的转化
3．6．4．2 重组质粒的筛选
3．6．4．3 重组质粒DNA的提取
3．6．4．4 重组质粒的酶切检测
3．6．4．5 目标片段的测序
4 结果与分析
4．1 枯萎病抗性的苗期鉴定
4．2 模板DNA的制备
4．3 RGA分析
4．3．1 RGA标记的筛选
4．3．2 同源序列的回收与克隆
4．3．2．1 同源序列的回收
4．3．2．2 重组质粒的筛选
4．3．2．3 重组质粒的酶切鉴定与测序
4．3．3 目标片段的碱基序列分析
4．3．4 目标片段编码的产物分析
4．3．5 目标片段的碱基序列同源性检索
4．3．6 目标片段编码的产物同源性检索
5 讨论
5．1 枯萎病抗性鉴定的准确性与可靠性
5．2 RGA引物的简并性与特异性
5．3 同源序列分析法的优越性
5．4 RGA标记筛选的效率与的准确性
5．5 抗病基因同源序列的复杂性
5．6 进一步研究方向
6 结论
参考文献
附录
致谢
发布时间: 2005-07-15
参考文献
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