论文摘要
目的:糖尿病（diabetes mellitus, DM）慢性血管并发症包括大血管和微血管的病变,如动脉硬化和糖尿病肾病,是DM致死、致残的主要原因。然而,目前糖尿病血管病变的发病机制尚不完全清楚,其中氧化应激和炎症损伤被广泛认为是重要的机制。DM时,诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）和环氧化酶-2 （cyclooxygenase-2, COX-2）可被诱导而活性增强,导致损伤。已有体外的研究报道,iNOS和COX-2之间存在相互作用。然而,在体内状态下iNOS和COX-2之间是否存在相互作用,其相互作用与糖尿病血管病变发病和进展的关系未见报道。DM时,过量的NO可与超氧阴离子（superoxide, O2-.）快速反应生成过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite, ONOO-）。ONOO-可引起蛋白质中酪氨酸残基明显的硝基化。一旦蛋白质被ONOO-引起硝基化,它们的结构和功能就会受到影响。而ONOO-引起的iNOS和COX-2的硝基化,对两者体内状态下,特别是糖尿病血管病变中的相互作用有何影响尚未见报道。尿酸盐（Urate）是特异的内源性ONOO-清除剂。滋阴活血方药（Nourishing Yin and Promoting Blood flow Recipe,NYPBR）是前期系列研究防治糖尿病并发症的核心方剂。本实验采用健康雄性Wistar大鼠,链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）复制DM模型,随机分为四组:正常组、DM组、Urate组、NYPBR组。实验中,检测iNOS和COX-2的转录水平、蛋白含量、两者的共定位和相互作用,以及iNOS和COX-2的硝基化水平,旨在探讨DM大鼠体内,iNOS和COX-2之间是否存在相互作用;iNOS和COX-2的相互作用与糖尿病大血管和微血管病变发病与进展的关系;ONOO-所致的iNOS、COX-2硝基化对其相互作用的影响;NYPBR防治作用机制是否是通过降低iNOS和COX-2的硝基化,影响其相互作用,从而起到防治糖尿病血管病变的目的。方法:1动物分组与取材健康雄性Wistar大鼠（407.05±59.51g）36只,随机分为4组,正常组（8只）,DM组（10只）,Urate组（9只）,NYPBR组（9只）,后三组腹腔内注射STZ溶液（STZ溶于浓度为0.1mol/L的柠檬酸纳缓冲液,pH4.4,新鲜配制,终浓度为10mg/mL,按40mg/kg注射）制备DM模型,正常组注射等剂量生理盐水。注射3天后,测空腹血糖,高于13mmol/L,尿糖+++以上,为造模成功。以上四组正常饮食喂养,正常组和DM组自由饮水,Urate组用Urate水溶液灌养（160mg/kg/d）,NYPBR组按人与动物间体表面积折算的等效剂量比值灌胃给药（含生药1g/mL）,每只大鼠3mL/天。20-25℃室温下喂养13周后,检测血糖、体重一次,股动脉放血处死,迅速剥离胸腹主动脉及肾组织,取一段主动脉及肾皮质用作形态学观察及激光共聚焦分析;剩余的主动脉和肾皮质迅速置于液氮中,-70℃冰箱保存,用于提取RNA,Western blotting,免疫共沉淀等分子生物学检测。2形态学观察主动脉内皮、肾皮质光镜和透射电镜下观察。3主动脉及肾皮质中iNOS和COX-2转录水平的检测Trizol一步法分别提取主动脉和肾皮质中总RNA;用β-actin做内参,RT-PCR方法检测iNOS和COX-2的mRNA表达。4主动脉及肾皮质中iNOS和COX-2蛋白含量及硝基化水平的检测分别取主动脉和肾皮质,匀浆后,Lowry法测定蛋白含量,Western-blotting检测主动脉及肾皮质中iNOS和COX-2的蛋白含量和其硝基化水平,即NT含量。5主动脉及肾皮质中iNOS和COX-2的共定位分别取主动脉和肾皮质,用激光共聚焦显微镜检测iNOS和COX-2的蛋白含量及其共定位。6主动脉及肾皮质中iNOS和COX-2的相互作用和硝基化水平6.1分别取主动脉和肾皮质,匀浆后,Lowry法测定蛋白含量,iNOS和COX-2的免疫共沉淀检测其相互作用。6.2 Western-blotting检测沉淀的iNOS和COX-2蛋白含量及其硝基化水平,即NT含量。结果:1大鼠的一般表现,Urate及NYPBR对大鼠血糖和体重的影响。造模3天后,DM组（21.68±2.95）、Urate组（23.28±3.98）和NYPBR组（21.93±3.93）血糖均较正常组（5.84±0.17）显著升高（P<0.001）。DM组大鼠逐渐出现消瘦,皮毛无光泽、疏松,反应迟钝,多饮、多尿、多食、生长迟缓等症状。Urate组和NYPBR组明显好于DM组。13周病程结束时,DM组血糖（22.20±5.57）明显高于正常组（6.05±0.94） ,体重（347.30±43.15）明显低于正常组（521.2±81.74）,有显著性差异（P<0.001）。Urate组血糖（18.88±3.21）与体重（320.44±61.78）均与DM组无差异。NYPBR组血糖（14.79±3.07）明显低于DM组（P<0.01）,体重（340.89±51.24）与DM组无差异。2主动脉形态学观察主动脉光镜（×400）下观察:正常组主动脉内皮完整,DM组内皮广泛脱落,Urate组和NYPBR组,主动脉内皮形态学改变介于以上两组之间。NYPBR组较Urate组的病理改变减轻。主动脉透射电镜（×20K或×40K）下观察:正常组内皮细胞内可见到大量吞饮小泡,线粒体完整。DM组内皮细胞可见大部分线粒体膜溶解、嵴消失,细胞连接融合或消失。Urate组和NYPBR组,内皮细胞线粒体的形态学改变减轻,细胞连接部分融合。NYPBR组较Urate组的病理改变减轻。3肾小球形态学观察肾小球光镜（×400）下观察:正常组肾小球未见异常,糖原染色可见基底膜薄而清晰。DM组,可见到肾小球纤维化、肾小囊腔增大,糖原染色可见基底膜增厚。Urate组和NYPBR组肾小球的形态学改变介于以上两组之间。NYPBR组较Urate组的病理改变减轻。肾小球透射电镜（×10K、×15K或×20K）下观察:正常组肾小球未见异常。DM组,可见系膜细胞及足突融合、基底膜增厚。Urate组和NYPBR组肾小球的形态学改变介于以上两组之间。NYPBR组较Urate组的病理改变减轻。4主动脉iNOS和COX-2转录水平的变化正常组iNOS和COX-2的mRNA表达未检测出,DM组iNOS的mRNA表达（0.57±0.05）、COX-2的mRNA表达（0.49±0.06）均明显增高。Urate组iNOS的mRNA表达（0.28±0.01）、COX-2的mRNA表达（0.29±0.02）较DM组显著降低（P<0.01）。NYPBR组iNOS的mRNA表达（0.22±0.03）、COX-2的mRNA表达（0.29±0.03）较DM组显著降低（P<0.01）。5肾皮质iNOS和COX-2转录水平的变化正常组iNOS和COX-2的mRNA表达未检测出,DM组iNOS的mRNA表达（0.43±0.07）、COX-2的mRNA表达（0.56±0.05）均明显增高。Urate组iNOS的mRNA表达（0.22±0.03）、COX-2的mRNA表达（0.22±0.03）较DM组显著降低（P<0.01）。NYPBR组iNOS的mRNA表达（0.11±0.03）、COX-2的mRNA表达（0.33±0.07）较DM组显著降低（P<0.01或P<0.05）。6主动脉iNOS和COX-2蛋白含量及其硝基化水平的变化正常组iNOS和COX-2的蛋白含量未检测出,DM组iNOS的蛋白含量（60.67±6.66）及其硝基化水平（0.83±0.14）、COX-2的蛋白含量（204.33±6.66）及其硝基化水平（0.43±0.02）均明显增高。Urate组iNOS的蛋白含量（44±5.29）及其硝基化水平（0.44±0.04）、COX-2的蛋白含量（158.67±19.5）及其硝基化水平（0.37±0.03）均比DM组降低（P<0.05）。NYPBR组iNOS的蛋白含量（47±2.65）及其硝基化水平（0.36±0.06）、COX-2的蛋白含量（161.67±12.1）及其硝基化水平（0.3±0.05）均比DM组降低（P<0.01或P<0.05）。7肾皮质iNOS和COX-2蛋白含量及其硝基化水平的变化正常组iNOS和COX-2的蛋白含量未检测出,DM组iNOS的蛋白含量（205.67±26.76）及其硝基化水平（0.54±0.02）、COX-2的蛋白含量（281.67±28.75）及其硝基化水平（1.64±0.12）均明显增高。Urate组iNOS的蛋白含量（142±10.54）及其硝基化水平（0.39±0.06）、COX-2的蛋白含量（182±8.62）及其硝基化水平（0.95±0.1）均比DM组降低（P<0.01或P<0.05）。NYPBR组iNOS的蛋白含量（131.67±11.02）及其硝基化水平（0.45±0.04）、COX-2的蛋白含量（152.33±9.07）及其硝基化水平（0.85±0.05）均比DM组降低（P<0.01或P<0.05）。8主动脉iNOS和COX-2蛋白含量及其共定位正常组,iNOS和COX-2的蛋白含量和共定位未检测出。DM组,iNOS蛋白含量（61.6±9.95）和COX-2蛋白含量（60.7±8.96）均显著增高,并出现明显的黄色,即iNOS和COX-2的共定位。Urate组,iNOS蛋白含量（23.24±4.15）和COX-2蛋白含量（42.38±4.2）比DM组降低（P<0.01或P<0.05）,黄色减弱。NYPBR组,iNOS蛋白含量（17.65±4.34）和COX-2蛋白含量（25.18±3.69）比DM组降低（P<0.01）,黄色减弱。9肾皮质iNOS和COX-2蛋白含量及其共定位正常组,iNOS和COX-2的蛋白含量和共定位未检测出。DM组,iNOS蛋白含量（20.52±2.73）和COX-2蛋白含量（16±1.59）均显著增高,并出现明显的黄色,即iNOS和COX-2的共定位。Urate组,iNOS蛋白含量（2.7±0.6）和COX-2蛋白含量（9.95±2.23）比DM组降低,黄色减弱（P<0.01或P<0.05）。NYPBR组,iNOS蛋白含量（4.75±2.28）和COX-2蛋白含量（10.91±2.05）比DM组降低,黄色减弱（P<0.01或P<0.05）。10主动脉iNOS和COX-2的相互作用及硝基化水平正常组,iNOS和COX-2的相互作用未检测出。DM组,发生相互作用的iNOS（0.92±0.12）及其硝基化水平（0.94±0.03）、COX-2（0.83±0.09）及其硝基化水平（1.3±0.11）均明显增加。Urate组发生相互作用的iNOS（0.65±0.09）及其硝基化水平（0.75±0.07）、COX-2（0.64±0.05）及其硝基化水平（1.08±0.07）均比DM组显著降低（P<0.05）。NYPBR组发生相互作用的iNOS（0.71±0.03）及其硝基化水平（0.85±0.03）、COX-2（0.55±0.12）及其硝基化水平（1.05±0.09）均比DM组显著降低（P<0.05）。11肾皮质iNOS和COX-2的相互作用及硝基化水平正常组,iNOS和COX-2的相互作用未检测出。DM组,发生相互作用的iNOS（0.8±0.03）及其硝基化水平（1.14±0.07）、COX-2（0.57±0.05）及其硝基化水平（1.21±0.09）均明显增加。Urate组发生相互作用的iNOS（0.6±0.07）及其硝基化水平（1.01±0.02）、COX-2（0.47±0.02）及其硝基化水平（1.02±0.06）均比DM组显著降低（P<0.05）。NYPBR组发生相互作用的iNOS（0.7±0.04）及其硝基化水平（0.84±0.09）、COX-2（0.44±0.05）及其硝基化水平（1.02±0.06）均比DM组显著降低（P<0.05）。结论:1 DM大鼠主动脉和肾皮质中,iNOS和COX-2的mRNA表达水平、蛋白含量均显著增高,并出现明显的共定位,提示糖尿病血管病变中,iNOS和COX-2之间可能存在相互作用。2 iNOS和COX-2相互作用的强弱与主动脉及肾小球的病理变化相一致,提示iNOS和COX-2的相互作用在糖尿病大血管和微血管病变发病中可能起重要作用。3 DM大鼠主动脉和肾皮质iNOS和COX-2被硝基化,且相互作用增强。Urate抑制硝基化后,iNOS和COX-2的相互作用减弱,病理损伤减轻。表明硝基化可增强iNOS和COX-2之间的相互作用,抑制iNOS和COX-2硝基化,可能在防治糖尿病血管病变中起关键作用。4 NYPBR可以抑制DM大鼠主动脉和肾皮质中iNOS和COX-2的硝基化,减弱其相互作用,起到防治糖尿病血管病变的作用。
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