寒胁迫下佛手差异表达基因的研究

论文摘要

佛手（Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle）是我国特有的经济树种,具有很高的观赏和经济价值,然而其耐寒性差,周期性的植物冷害严重制约了佛手产业的发展,人们一直致力于通过抗寒育种的方法解决植物抗寒能力差的问题,而植物抗寒机理的研究是抗寒育种的理论基础,其研究进展直接制约着培育低温品种和改良现有品种的进程。本试验以抗寒的枳和抗寒较弱的青皮佛手品种2年生盆栽植株为试材,进行4℃低温处理,研究佛手低温胁迫下的基因表达差异,并比较佛手和枳寒胁迫下的生理生化变化及寒胁迫相关基因的表达差异,采用抑制消减杂交,reverse northern blot,荧光定量PCR等分子生物学研究手段探讨佛手和枳的抗寒机制。1.以两年生“青皮”佛手（C. medica cv.’Qingpi’）为试材,在4℃24 h处理下进行抑制消减杂交（SSH）分析,筛选佛手低温胁迫下的差异表达片段；分别以未经低温处理的植株作为“driver",经过低温处理的植株作为"tester";提取叶片组织的总RNA并分离mRNA,再逆转录成双链的tester cDNA和driver cDNA;经过两次消减杂交和两次PCR扩增,富集寒胁迫下佛手的差异表达片段。结果获得了200个克隆,筛选菌液PCR产物集中在250 bp-1 kbp之间的111个差异片段进行测序,序列比对分析显示其中的57个ESTs功能已知,通过reverse northern blot结果显示,冷诱导ESTs多数是阳性克隆,并且表达量上调。2.以4℃低温处理24 h的两年生“青皮”佛手为试材,采用5’RACE和RT-PCR方法克隆佛手低温胁迫的差异基因GRAS和ERF基因的cDNA序列全长,并进行序列分析；通过与Genbank中其他植物的GRAS和ERF基因同源序列比对,并根据保守区序列设计引物进行克隆；克隆获得的佛手GRAS基因CmsGRAS （GenBank登录号：JF440647）,全长1669 bp,编码区长1236 bp,编码413个氨基酸；序列分析显示该基因与拟南芥已知的GRAS基因同源性较高,具有GRAS特有的保守结构域；获得的佛手ERF基因CmsERF6 （Genbank登录号为：HQ698835）, cDNA全长1160 bp,开放阅读框999 bp；序列分析显示该基因含有一个保守的AP2/EREBP结构域,并与拟南芥AtERF6为同源基因。3.以两年生的“青皮”佛手和枳（Poncirus trifoliata Raf.）为试材,使用实时荧光定量PCR方法检测不同时间4℃低温处理下,佛手和枳叶片中GRAS和ERF基因mRNA的表达差异；并结合测定佛手和枳寒胁迫下的电解质渗出率、丙二醛含量,以明确佛手和枳的耐寒性和分子应答差异。结果显示,4℃低温胁迫后,佛手、枳的MDA和电导率均呈上升趋势,且佛手变化更强烈、胁迫伤害更大；GRAS基因在佛手和枳低温胁迫中表达量均上升,其中枳上升更为明显,其低温处理24 h时表达量达到对照的800倍；ERF6基因的表达变化在佛手和枳中存在明显差异,佛手在4℃低温处理12h后ERF6表达量迅速上升约12倍,48 h后恢复到对照组水平,而枳在低温处理24 h内ERF6表达仅有较小幅度的上升,处理48 h后与对照组相比上升约4000倍,这表明低温对佛手与枳的ERF6表达均具有诱导作用,但表达量的变化趋势存在明显的差异。GRAS和ERF基因表达量的增加可能与低温胁迫应答有关；本文推测佛手和枳可能具有不同的抗寒机制,且ERF6可能在枳的强耐寒性中发挥重要作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 符号说明
• 第一章 文献综述
• 1 植物对低温逆境适应性的生理及分子机制
• 1.1 植物抗寒机理研究的重要性和必要性
• 1.2 柑橘属植物抗寒生理研究
• 1.3 柑橘属植物抗寒分子研究
• 2 植物低温逆境胁迫的信号传导和基因表达调控
• 2.1 植物低温胁迫的信号传导途径
• 2.2 植物低温胁迫的基因表达调控
• 3 本研究的目的意义及研究路线
• 第二章 佛手寒胁迫诱导基因的筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 总RNA的提取及mRNA的纯化
• 2.2 链cDNA合成和RsaⅠ酶切效率
• 2.3 接头连接效率检测
• 2.4 消减杂交产物的2次PCR扩增结果
• 2.5 消减杂交效果分析
• 2.6 第二次PCR产物连接T载体
• 3 讨论
• 第三章 佛手寒胁迫诱导基因的鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 PCR检测消减文库质量
• 2.2 消减cDNA ESTs序列的统计与分析
• 2.3 消减cDNA ESTs功能分类
• 2.4 Reverse northern blot验证
• 3 讨论
• 第四章 佛手寒胁迫诱导基因GRAS和ERF转录因子的克隆和序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 材料处理
• 1.3 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 GRAS基因cDNAs的克隆
• 2.2 ERF基因cDNAs的克隆
• 2.3 基因比对分析
• 3 讨论
• 第五章 寒胁迫下佛手与枳生理指标测定及GRAS、ERF6转录因子表达量变化的比较
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 材料处理
• 1.3 主要仪器与试剂
• 1.4 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 4℃低温处理对佛手和枳叶片寒胁迫生理指标的影响
• 2.2 GRAS在佛手和枳中低温处理不同时间的表达定量分析
• 2.3 ERF6在佛手和枳中低温处理不同时间的表达定量分析
• 3 讨论
• 3.1 佛手和枳的抗寒生理指标的测定
• 3.2 GRAS在佛手和枳中低温处理不同时间的表达定量
• 3.3 ERF6在佛手和枳中低温处理不同时间的表达定量
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文