利用红酵母发酵生产类胡萝卜素及其功能性质研究

论文题目: 利用红酵母发酵生产类胡萝卜素及其功能性质研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 发酵工程

作者: 张坤生

导师: 肖冬光

关键词: 红酵母,类胡萝卜素,分批发酵,胡萝卜素,色素,抗氧化

文献来源: 天津科技大学

发表年度: 2005

论文摘要: 本论文根据酵母发酵原理和天然色素特点,研究了红酵母（Rhodotorula glutinis）发酵产生色素的条件及其色素分离、测定和功能性质研究。主要研究内容和结果如下: （1）以红酵母为出发菌株,利用二苯胺为筛选剂,通过紫外诱变,经筛选得到一株高产类胡萝卜素菌株Ruv701,通过发酵性能测定及遗传稳定性鉴定,此菌株为优良菌株。摇瓶发酵比出发菌株提高42.16%,达到13.25mg/L。5L罐发酵类胡萝卜素产量达到37.21mg/L,比非诱变菌株5L罐发酵类胡萝卜素产量提高62.56%。 （2）提取红酵母色素的工艺条件为,研磨破壁,在35℃下,采用石油醚-丙酮溶剂,提取30min。 利用浓硫酸与类胡萝卜素的氯仿溶液发生深蓝色的反应可进行红酵母色素组分的定性分析。 用高效液相色谱法（HPLC）可对红酵母色素进行定量测定。色谱柱:RP-ODS-C18;柱温:35℃;流动相:乙腈∶四氢呋喃=60∶40;流速:1mL/min;进样量:10uL。 用薄层层析法（TLC）、色谱柱层析、分光光度法、HPLC和质谱分离并分析红酵母色素。证明至少有三种组分,其中一种是β-胡萝卜素,其它可能是圆酵母素、红酵母红素。 超临界CO2萃取红酵母色素的工艺参数:萃取压力18-19Mpa,萃取温度44.5-45.0℃,CO2流量4.8-10.5ml/min,萃取时间10min。 （3）通过单因素实验发现发酵红酵母产类胡萝卜素的最佳碳源为蔗糖,最佳氮源为酵母粉。添加番茄汁（3.0mL/L）或花生油（8mL/L）有利于生产。 通过均匀设计试验得到促进红酵母发酵产生类胡萝卜素的金属离子的最佳添加量:K2SO41.0%、MgSO4·7H2O 0.05%、CuSO4·5H2O 0.0045%。 通过响应面试验,得出几种维生素对类胡萝卜素发酵的影响的方程:Y=12.3+0.0675X1+0.06X2+0.0725X3-0.1975X12+0.1275X22-0.045X2*X1-0.09X3*X1+0.04X3*X2-0.1935X32。据此优化出发酵培养基中三种维生素的添加量:VB10.2mg/L、VB2 1.0mg/L、VC 0.7mg/L。 （4）通过研究不同发酵条件对红酵母发酵类胡萝卜素的影响,获得诱变高产菌株5L罐发酵培养条件:培养基初始值pH6.0,发酵温度28℃,发酵周期76h,初始糖浓度20g/L,流加糖至总糖浓度100g/L,保持残糖在10-20g/L,溶氧15-25%,酵母粉30g/L。实验结果表明,在此条件下生物量为43.83g/L、类胡萝卜素含量848.82μg/g,糖的转化率0.372mg/g。

论文目录:

摘要

Abstract

第一章 绪论

1.1 类胡萝卜素概述

1.1.1 类胡萝卜素名称的由来

1.1.2 类胡萝卜素的存在状态

1.1.3 类胡萝卜素的种类

1.1.4 类胡萝卜素的生物作用

1.1.5 β-胡萝卜素的来源

1.2 红酵母与类胡萝卜素

1.2.1 红酵母的分类及概况

1.2.1.1 红酵母的分类地位

1.2.1.2 类胡萝卜素类色素

1.2.2 目前用红酵母生产色素的概况

1.3 类胡萝卜素结构及功能

1.3.1 类胡萝卜素的结构

1.3.1.1 类胡萝卜素的结构特征

1.3.1.2 几种典型的类胡萝卜素结构式

1.3.2 类胡萝卜素的功能性质

1.3.2.1 类胡萝卜素猝灭单线态氧性质

1.3.2.2 类胡萝卜素抵抗疾病作用

1.3.2.3 缺乏类胡萝卜素的危害

1.3.2.4 类胡萝卜素防治疾病的机理

1.3.3 抗氧化性与化学发光

1.3.3.1 天然抗氧化剂与活性氧

1.3.3.2 活性氧与自由基

1.3.3.3 生物大分子的损伤与自由基

1.4 类胡萝卜素的生产方法

1.4.1 从植物中提取类胡萝卜素

1.4.2 化学法合成类胡萝卜素

1.4.3 发酵法生产类胡萝卜素

1.5 类胡萝卜素的提取与分离

1.5.1 溶剂法提取类胡萝卜素

1.5.2 超临界流体萃取分离技术

1.6 发酵法生产类胡萝卜素研究进展

1.6.2 类胡萝卜素的合成途径

1.6.3 产类胡萝卜素菌株的诱变

1.6.4 类胡萝卜素发酵工艺的研究

1.6.5 基因工程生产类胡萝卜素

1.6.6 发酵法生产类胡萝卜素和β-胡萝卜素的优点

1.7 类胡萝卜素分析方法的研究

1.7.1 在类胡萝卜素研究中高效液相色谱法的应用

1.7.2 样品前处理和类胡萝卜素的提取

1.7.3 类胡萝卜素研究中的HPLC检测器

1.7.4 在类胡萝卜素检测中HPLC的应用

1.8 论文研究背景及主要研究内容

1.8.1 研究背景及意义

1.8.2 主要研究内容

参考文献

第二章 红酵母类胡萝卜素检测方法的研究

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 主要仪器

2.2.2 主要试剂

2.2.3 实验方法

2.2.3.1 红酵母样品及色素的制备

2.2.3.2 红酵母色素的定性测定

2.2.3.3 定量测定红酵母中的色素

2.3 结果与讨论

2.3.1 红酵母细胞破壁方法的选择

2.3.2 类胡萝卜素提取条件的确定

2.3.2.1 有机溶剂选择

2.3.2.2 有机溶剂比例的确定

2.3.3 红酵母色素的定性测定

2.3.3.1 红酵母色素的颜色定性测定

2.3.3.2 红酵母抽提物及β-胡萝卜素的薄层层析

2.3.3.3 红酵母色素的HPLC定性测定实验

2.3.4 红酵母中类胡萝卜素的定量测定

2.3.4.1 反相HPLC法定量测定红酵母中β-胡萝卜素的含量

2.3.4.2 分光光度法测定红酵母色素中的类胡萝卜素含量

2.4 本章小结

参考文献

第三章 红酵母菌的诱变育种

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 实验材料

3.2.1.1 菌种

3.2.1.2 主要试剂

3.2.1.3 主要溶液

3.2.1.4 培养基种类

3.2.2 主要仪器

3.2.3 实验方法

3.2.3.1 出发菌株生长曲线的绘制

3.2.3.2 出发菌株抗药性检验

3.2.3.3 出发菌株致死曲线

3.2.3.4 产类胡萝卜素菌株的诱变方法

3.2.3.5 产类胡萝卜素菌株的筛选方法

3.2.3.6 产类胡萝卜素菌株的发酵性能测定

3.2.3.7 产类胡萝卜素菌突变株的遗传稳定性检验

3.2.3.8 产类胡萝卜素菌株的5L罐试验

3.2.4 分析方法

3.2.4.1 测定类胡萝卜素的方法

3.2.4.2 测定发酵液中葡萄糖的方法

3.2.4.3 测定发酵液中蔗糖的方法

3.3 结果与讨论

3.3.1 生长曲线

3.3.2 抗药性

3.3.3 致死曲线

3.3.4 产类胡萝卜素菌株的紫外诱变

3.3.5 产类胡萝卜素菌株的突变株筛选

3.3.6 测定产类胡萝卜素菌株的诱变菌株的发酵性能

3.3.7 产类胡萝卜素菌株的突变株遗传稳定性测定

3.3.8 诱变育种机理简析

3.4 本章小结

参考文献

第四章 培养基及发酵条件对类胡萝卜素积累的影响

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 菌种

4.2.2 主要仪器

4.2.3 主要试剂

4.2.4 主要溶液

4.2.5 培养基

4.2.6 实验方法

4.2.6.1 种子培养

4.2.6.2 摇瓶培养

4.2.7 分析方法

4.2.7.1 测定类胡萝卜素的方法

4.2.7.2 测定发酵液中葡萄糖的方法

4.2.7.3 测定发酵液中蔗糖的方法

4.2.7.4 测定发酵液中pH值

4.3 结果与讨论

4.3.1 优化发酵培养基的作用

4.3.1.1 碳源种类对类胡萝卜素发酵的作用

4.3.1.2 氮源对类胡萝卜素发酵的影响

4.3.1.3 正交实验培养条件中的主要因素

4.3.1.4 几种氮源含量对类胡萝卜素发酵的影响

4.3.1.5 类胡萝卜素发酵中金属离子的作用

4.3.1.6 类胡萝卜素发酵中维生素的作用

4.3.1.7 类胡萝卜素发酵中添加前体物的作用

4.3.2 优化类胡萝卜素发酵培养的条件

4.3.2.1 温度对类胡萝卜素发酵的影响

4.3.2.2 类胡萝卜素发酵与初始pH值的关系

4.3.2.3 类胡萝卜素发酵与溶氧的关系

4.3.2.4 优化条件与初始条件的摇瓶发酵实验

4.3.2.5 摇瓶发酵过程中产物的变化

4.3.3 类胡萝卜素发酵中补料分批发酵

4.3.3.1 类胡萝卜素发酵中糖浓度的影响

4.3.3.2 类胡萝卜素发酵中使用分批补糖的效果

4.3.3.3 类胡萝卜素发酵与分批补氮的效果

4.3.4 5L罐补料分批培养红酵母条件的研究

4.3.4.1 在5L发酵罐中流加分批培养对产物和pH值的影响

4.3.4.2 类胡萝卜素发酵与控制不同的pH值的关系

4.3.4.3 不同的溶氧水平对类胡萝卜素发酵的影响

4.3.5 分批发酵红酵母的动力学模型

4.3.5.1 菌体生长的动力学模型

4.3.5.2 产物形成的动力学模型

4.3.6 诱变高产菌株的5L罐试验

4.4 本章小结

参考文献

第五章 红酵母中类胡萝卜素提取技术研究

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 主要仪器和设备

5.2.2 主要试剂

5.2.3 实验方法

5.2.3.1 红酵母发酵及冷冻干燥红酵母菌体

5.2.3.2 有机溶剂浸提红酵母色素

5.2.3.3 用超声波提取红酵母色素

5.2.3.4 用微波提取红酵母色素

5.2.3.5 超临界流体萃取红酵母色素研究

5.2.3.6 几种红酵母色素提取方法的比较

5.2.3.7 β—胡萝卜素稳定性的研究

5.2.3.8 不同的试剂对β—胡萝卜素紫外光谱的影响

5.3 结果及讨论

5.3.1 有机溶剂浸提实验结果

5.3.1.1 溶剂单因素实验结果

5.3.1.2 温度对提取效果的影响

5.3.1.3 不同提取时间对提取效果的影响

5.3.1.4 不同料液比的提取效果

5.3.1.5 正交实验法提取红酵母色素

5.3.1.6 确定红酵母色素提取的级数

5.3.2 超声波提取的效果

5.3.3 用微波提取红酵母色素

5.3.3.1 微波提取的功率

5.3.3.2 微波提取的最佳时间的确定

5.3.4 浸提、超声波提取和微波提取三种方法的结果比较

5.3.5 超临界流体萃取红酵母色素

5.3.5.1 类胡萝卜素在超临界流体萃取时的溶解度

5.3.5.2 超临界CO_2萃取分离红酵母色素的实验结果

5.3.6 β—胡萝卜素稳定性的研究

5.3.6.1 β—胡萝卜素标准曲线制作

5.3.6.2 β—胡萝卜素的稳定性

5.3.6.3 不同的溶剂对β—胡萝卜素的紫外光谱的影响

5.4 本章小结

参考文献

第六章 红酵母色素功能性质的研究

6.1 引言

6.2 材料与方法

6.2.1 主要仪器

6.2.2 主要试剂

6.2.3 实验方法

6.2.3.1 红酵母色素基本化学性质研究

6.2.3.2 化学反应法研究红酵母色素抗氧化能力

6.2.3.3 化学发光法研究红酵母色素的抗氧化性

6.3 结果与讨论

6.3.1 红酵母色素稳定性的研究

6.3.1.1 温度与红酵母色素的稳定性

6.3.1.2 光照与红酵母色素的稳定性

6.3.1.3 酸与红酵母色素的稳定性

6.3.1.4 红酵母色素的稳定性与氧化剂

6.3.1.5 红酵母色素的稳定性与还原剂

6.3.2 化学反应法研究红酵母色素的抗氧化能力

6.3.2.1 红酵母色素的还原力

6.3.2.2 羟自由基清除能力与红酵母色素的关系

6.3.2.3 抗卵磷脂脂质体氧化能力与红酵母色素的关系

6.3.2.4 红酵母色素的抗亚油酸脂质体氧化能力

6.3.3 化学发光法研究红酵母色素的抗氧化性

6.3.3.1 红酵母色素抽提液的抗氧化性

6.3.3.2 β-胡萝卜素的抗氧化性

6.3.3.3 红酵母色素抽提液的发光抑制效果

6.4 本章小结

参考文献

第七章 红酵母色素的分离及结构测定

7.1 引言

7.2 材料与方法

7.2.1 主要仪器

7.2.2 主要试剂

7.2.3 实验方法

7.2.3.1 色谱柱分离红酵母色素

7.2.3.2 薄层层析法分离和鉴定红酵母中色素

7.2.3.3 红酵母色素中各组分的紫外可见光谱

7.2.3.4 红酵母色素中各组分的质谱分析

7.3 结果及讨论

7.3.1 色谱柱分离结果

7.3.2 薄层层析结果

7.3.2.1 薄层层析红酵母色素

7.3.2.2 紫外及可见光扫描及图谱解析

7.3.3 质谱及解析

7.4 本章小结

参考文献

第八章 全文总结与展望

8.1 全文总结

8.2 本论文创新点

8.3 展望

致谢

在攻读博士期间发表论文

发布时间: 2007-01-10

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