超量表达柑橘八氢番茄红素合成酶基因citPSY草莓新种质的创制

论文摘要

草莓（Fragaria ananassa Duch）属于蔷薇科草莓属多年生草本植物,是世界上广泛栽培的重要草本果树之一,具有生长周期短,果实外形美观、风味独特、富含花青苷等特点。柑橘果树童期长,色素代谢相关的功能基因验证较为困难,草莓基因工程育种为解决这一问题提供了新的途径。柑橘八氢番茄红素合成酶基因citPSY是类胡萝卜素生物合成途径中的一个限速酶。通过利用根癌农杆菌介导的转化方法将柑橘citPSY基因导入草莓中,可望获得富含类胡萝卜素和花青苷的转基因草莓植株；同时,可研究类胡萝卜素基因表达的改变对花青苷等其它次生代谢产物的影响,以深入研究植物类胡萝卜素生物合成和调控的特性。本研究的主要结果如下：1.优化了草莓离体再生体系以MS+1.5 mg/L TDZ+0.2 mg/L IBA为不定芽诱导培养基,对草莓‘全明星’（Allstar）叶片诱导效果最佳。通过2-4 w的暗培养有效地提高再生频率,愈伤组织再生率为97.1%,不定芽诱导率为55.2%,平均每个外植体出芽2.09个2.建立了草莓遗传转化体系,获得一批转化植株以根癌农杆菌介导基因转化,对影响遗传转化效率的各种因素进行筛选,确定有效Kan筛选压为10 mg/L,确定合适的抗菌素Cef浓度为250 mg/L,并获得一条最佳的转化途径：外植体叶片在再生培养基上预培养2d；农杆菌活化至对数生长期再重新悬浮培养至OD600=0.3-0.5,后用等体积MS液体培养基重悬；叶盘侵染时间约7 min,共培养3 d；用含250 mg/L Cef液体MS培养基漂洗1-2次后,将外植体接种含于250 mg/L Cef固体MS再生培养基上,推迟筛选2w；2w后将外植体接种于10 mg/L Kan+250 mg/L Cef的再生培养基上进行选择培养。3.转基因植株PCR检测通过浓度为10 mg/L的Kan选择压初步筛选出14棵转化植株,以未转化植株为阴性对照,质粒DNA为阳性对照,citPSY基因两端特异性引物进行PCR扩增检测。检测结果表明：在14株抗性植株中有3株经PCR扩增出的特异性条带与阳性质粒条带一致,阴性对照未能扩增出任何条带。这表明citPSY基因已经整合进这些植株的基因组DNA中

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 主要符号及缩略语表
• 1 前言
• 1.1 草莓再生体系的研究进展
• 1.1.1 草莓外植体再生途径
• 1.1.2 外植体对草莓再生体系的影响
• 1.1.3 草莓再生途径的培养基与培养条件
• 1.2 草莓遗传转化体系的研究进展
• 1.2.1 草莓遗传转化途径
• 1.2.2 外植体对转化效率的影响
• 1.2.3 预培养对转化效率的影响
• 1.2.4 农杆菌侵染对转化效率的影响
• 1.3 草莓基因工程进展
• 1.3.1 草莓抗病虫基因工程研究
• 1.3.2 草莓抗逆基因工程
• 1.3.3 草莓耐贮运性基因工程研究
• 1.3.4 草莓品质基因工程的研究
• 1.3.5 草莓抗除草剂转基因研究
• 1.4 课题的提出与目的
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 细菌材料
• 2.1.3 主要生化试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 草莓无菌试管苗材料的准备
• 2.2.2 接种方法
• 2.2.3 统计方法
• 2.2.4 草莓叶片转化条件的优化
• 2.2.5 培养基
• 2.2.6 农杆菌叶盘法转化程序
• 2.2.7 抗性芽的增殖与生根
• 2.2.8 转基因草莓的分子生物学鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 草莓遗传转化因子的确定
• 3.1.1 选择合适的TDZ浓度
• 3.1.2 暗处理对草莓再生的影响
• 3.1.3 确定Kan筛选压
• 3.1.4 确定Cef抑菌剂浓度
• 3.1.5 选择合适的农杆菌侵染浓度及时间
• 3.1.6 预培养、共培养对叶片再生的影响
• 3.1.7 推迟筛选对叶片再生的影响
• 3.2 抗性植株的获得
• 3.3 抗性植株的生根
• 3.4 转化阳性苗PCR鉴定
• 4 讨论
• 4.1 TDZ对叶片再生的影响
• 4.2 切割方式
• 4.3 暗培养
• 4.4 筛选条件与筛选方式
• 4.5 实验不足与展望
• 参考文献
• 图版与图版说明
• 致谢