论文摘要
目的:本实验采用蛋白酶体抑制剂硼替佐米（Bortezomib,BOR）联合亚砷酸（Arsenic Trioxide,ATO）动态观察对人急性早幼粒细胞白血病（acutepromyelocytic leukemia,APL）细胞株NB4的凋亡和生长抑制作用,探讨蛋白酶体抑制剂能否增加NB4细胞对亚砷酸的敏感性以及和亚砷酸能否协同诱导NB4细胞凋亡,为APL开拓新的治疗方法,同时为BOR与ATO二者联合应用于临床提供理论依据。方法:将受试对象分为9组:正常对照组（D）;5 nmol/L BOR（A1）,10 nmol/LBOR（A2）;0.5μmol/L ATO（B1）,1.0μmol/L ATO（B2）:5 nmol/L BOR+0.5μmol/LATO（C1）,5 nmol/L BOR+1.0μmol/LATO（C2）,10 nmol/L BOR+0.5μmol/L ATO（C3）,10 nmol/L BOR+1.0μmol/L ATO（C4）。作用时间分为三个水平:24小时,48小时,72小时,检测以下相关指标的变化:（1）瑞氏—姬姆萨染色后高倍显微镜下观察细胞形态的变化;（2）四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测药物对细胞的生长抑制效应;（3）流式细胞仪检测细胞凋亡率及进行细胞周期分析;（4）逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测抑凋亡基因survivin的表达变化情况。结果:（1）形态学的观察:细胞凋亡时细胞外形迅速皱缩,体积明显减小;核皱缩,染色质凝聚成致密团块,随之细胞核碎裂成小的圆形致密团块,散布于胞质中;晚期产生的细胞碎片呈簇状分布于细胞周围。5 nmol/L BOR与10 nmol/L BOR作用于NB4细胞后,光镜下可观察到细胞的凋亡,且随着药物浓度的增高,凋亡细胞的数量也增多。1μmol/L ATO+10 nmol/L BOR作用于NB4细胞24小时后可见核膜皱缩,48小时部分胞浆内见空泡变性,72小时为凋亡高峰,可见核固缩、核仁裂解、细胞内染色质凝集,细胞部分裂成数个质膜包裹小体即凋亡小体。（2） MTT结果显示:在同一时点,与对照组相比,单药组与联合组均使NB4细胞生存率显著下降（P＜0.01）,各组呈浓度效应关系。同一药物浓度作用于不同时点生存率也明显不同（P＜0.01）,呈时间依赖性。联合组抑制作用明显优于单药组,以1μmol/L ATO联合10 nmol/L BOR在72小时生存率最低（P＜0.01）。（3）流式细胞仪结果显示:BOR组培养细胞48小时后,S期比例逐渐降低,G1期变化不明显,而G2/M期逐渐升高,将细胞周期阻滞于G2/M期（P＜0.01）,ATO组培养细胞48小时后,同样将细胞周期阻滞于G2/M期（P＜0.01）,联合组处理细胞后,均使细胞周期阻滞于G2/M期（P＜0.01）,两种药物之间存在交互作用,1μmol/LATO联合10 nmol/L BOR阻滞率最高,与相同剂量的ATO单用组比较,联合组的阻滞率显著增高（P＜0.01）。对细胞凋亡的分析表明,BOR组处理细胞48小时后均可见凋亡亚G1期峰,而对照组无明显凋亡峰,凋亡率的高低具浓度依赖性（P＜0.01）。BOR能增强ATO对NB4细胞的凋亡作用,与相同剂量的ATO单用组比较,联合组的凋亡率显著增高（P＜0.05）。两种药物之间存在交互作用,10 nmol/L BOR+1μmol/L ATO组处理后凋亡率最高（P＜0.01）。（4） PT-PCR检测结果显示:BOR组与ATO组均能下调抑凋亡基因survivin的表达水平,并呈浓度和时间依赖性（P＜0.01）。联合组降低survivin的表达比单药组明显,联合组与ATO组相同ATO浓度相比,同一时点survivin的表达量随BOR浓度的升高而降低,差异具显著性（P＜0.01）。干预时相与两药干预浓度之间存在交互作用（P＜0.01）,以1μmol/L ATO联合10 nmol/L BOR在72小时survivin的表达量最低。结论:（1） BOR与ATO单药应用均可诱导细胞凋亡,且存在剂量与时间依赖性;能够将NB4细胞周期阻滞于G2/M期并抑制该期高表达的survivin mRNA的产生可能是其诱导凋亡的机制。（2） BOR可增强ATO对NB4细胞的杀伤作用,两药联合对其生存率的影响具有相加效应。（3） BOR可增强ATO诱导的细胞凋亡作用,其机制可能与提高G2/M期的阻滞率与降低survivin mRNA转录水平有关,二药联合具有相加或协同作用。