多疣壁虎血小板衍生生长因子C（gPDGF-C）基因的克隆及表达

论文摘要

目的:获得多疣壁虎（Gekko japonicus）血小板衍生生长因子C（Platelet-derived growth factor C）的全长序列,分析其基本生物学特征。研究PDGF-C在壁虎断尾损伤前后的表达变化。观察gPDGF-C在细胞中的表达和定位,并对其核定位信号进行初步预测。构建gPDGF-C的原核表达载体。方法:应用RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）技术从壁虎的脊髓组织中获得PDGF-C的全长序列;Northern blot验证其转录本的大小及其在不同组织中的表达;用免疫组织化学的方法观察gPDGF-C蛋白在正常脊髓中的表达;制备壁虎断尾损伤模型,通过原位杂交的方法检测gPDGF-C mRNA在壁虎正常脊髓及损伤模型断端近侧脊髓中的分布;采用RT-PCR和Western blot方法验证该基因在断尾前后脊髓中的表达变化;通过构建含PDGF-C不同序列的三种质粒转染壁虎Gsn1和Gsn3细胞株和COS7细胞株观察gPDGF-C在细胞中定位的变化;构建gPDGF-C编码区序列的原核表达质粒,通过SDS-PAGE电泳分析鉴定融合蛋白的表达。结果:（1）gPDGF-C mRNA全长2793 bp,编码345个氨基酸,编码蛋白与其他物种的同源性在80-88%之间,其N端具有一段信号肽,位于第1～22位氨基酸,剪切位点可能在第22和23位氨基酸残基之间。Northern blot显示PDGF-C在组织中广泛表达,心、肺、肾、卵巢组织中高表达,脑、脊髓、肝组织中一般表达,且正常壁虎体内只发现一个转录本,大小约2.8kb。（2）免疫组织化学显示PDGF-C阳性的细胞主要分布于脊髓的灰质,且前角的表达量多于后角,中央管周围也有少量的表达,且PDGF-C蛋白主要定位于细胞浆中,细胞核中的表达量较低。与神经元烯醇化酶（NSE）双标的结果显示,两者有很好的共定位,说明壁虎脊髓中NSE阳性的神经元中有PDGF-C的表达。（3）原位杂交结果显示,gPDGF-C阳性信号主要分布于脊髓灰质中,白质中仅有少量表达,且前角细胞表达量多于后角细胞,室管膜细胞表达量最高;断尾损伤后1d阳性信号明显增强,室管膜和前后角细胞中的表达量均高于正常脊髓;损伤后7d阳性信号有所减少。（4）RT-PCR和Western blot均表明断尾损伤后的近端脊髓组织中,PDGF-C表达呈动态变化:损伤后1d信号明显增强,此后逐渐下降,2w时基本接近正常水平。（5）转染壁虎Gsn1和Gsn3细胞株和COS7细胞株均显示pEGFP-N3- PDGF-C-FL为胞浆定位,pEGFP-N3- PDGF-C-CD主要定位在细胞核,胞浆中有少量表达,而pEGFP-N3- PDGF-C-NLS del则是全细胞定位。说明gPDGF-C的C端存在一段核定位信号。（6）成功构建GST-PDGF-C-ORF重组质粒,并在大肠杆菌中获得有效表达,为体外纯化gPDGF-C活性蛋白,研究其生物学功能做准备。结论（1）获得壁虎PDGF-C基因的全长序列。（2）gPDGF-C mRNA在正常壁虎组织中广泛表达。（3）壁虎断尾损伤后近端脊髓PDGF-C在体内的表达上调。（4）gPDGF-C的C端存在一段核定位信号。（5）成功构建GST-PDGF-C-ORF重组质粒,并在大肠杆菌中获得有效表达。

论文目录

• 英文缩写词表（Abbreviation）
• 中文摘要（Abstract in Chinese）
• 英文摘要（Abstract in English）
• 前言（Introduction）
• 材料和方法（Material and Method）
• 结果（Results）
• Ⅰ gPDGF-C 的基本特征
• Ⅱ 断尾后脊髓中gPDGF-C 的表达变化
• Ⅲ gPDGF-C 在真核细胞中的表达和定位
• Ⅳ 构建gPDGF-C 原核表达质粒
• 讨论（Discussion）
• 结论（Conclusion）
• 参考文献（References）
• 综述（Review）
• 综述参考文献（References）
• 致谢（Acknowledgements）
• 攻读硕士期间发表论文及奖励