论文摘要
[研究背景]EWI-2（又名CD316,IgSF8或者鼠源性PGRL）是近年新发现的免疫球蛋白超家族成员。EWI-2蛋白具有四到六个细胞外免疫球蛋白结构域,而且具备由10到27个氨基酸组成的胞内短的跨膜拖尾结构,EWI-2最先是作为tetraspanin的结合蛋白而被发现的,它的这种跨膜结构允许其能够直接与tetraspanin家族成员CD9,CD81相结合并且发挥功能性作用。此外,EWI-2胞内段可以与ERM蛋白直接结合从而影响tetraspanin与细胞骨架的连接进而影响其功能。细胞粘附分子是位于细胞表面的蛋白质。它们主要的功能在于与细胞外基质以及周围的细胞相结合。这些穿膜蛋白都具有三个基本的结构域:（1）细胞外结构域,与其它细胞粘附分子相结合;（2）细胞内结构域,与细胞骨架相结合;（3）穿膜结构域。IgSF家族作为细胞粘附分子的一员主要在非钙离子依赖的情况下发挥功能,这些蛋白是可溶性的并且具有免疫球蛋白的结构特点。EWI家族作为IgSF的亚家族包括许多新的蛋白例如EWI-2、EWI-F、PRP/CD9P-1、IgSF3、CD101等。EWI在具有免疫球蛋白超家族成员共有的高度同源氨基酸序列的基础上形成了新的EWI免疫球蛋白亚家族。FPRP/CD9P-1作为亚家族的成员也可以与tetraspanin结合。然而,亚家族成员IgSF3和CD101是否也能与tetraspanin结合至今尚不明确。据报道,EWI-2还能够与tetraspanin 家族成员 KAI1/CD82（Tspan27）相结合,而 KAI1/CD82（Tspan27）在肿瘤的迁移抑制方面发挥着重要作用。因此,EWI-2与CD82的结合具有抑制肿瘤迁移的作用。尽管EWI-2的生物学功能尚不明确,但是EWI-2-tetraspanin的相互结合能够影响tetraspanin家族的功能,如细胞粘着、细胞迁移、细胞侵袭以及核聚变等。正因为tetraspanin家族具有调节肿瘤细胞迁移的决定性作用,所以EWI-2可能是通过直接或者间接的结合来调控肿瘤细胞的运动。如过表达EWI-2能够抑制肿瘤细胞向胶原蛋白和纤维粘连蛋白的迁移;相反的,EWI-2基因沉默可以促进肿瘤细胞的迁移。然而在高表达EWI-2的组织内,例如前列腺、睾丸、脑和肾脏中,EWI-2表达在细胞微突触部位,进而影响细胞的相互粘附。以往研究表明,热休克蛋白A8作为EWI-2的配基而表达在树突状细胞间连接的位置,U87动物模型中过表达的EWI-2能够明显抑制肿瘤的生长和大小。而且EWI-2在恶性转移的脑肿瘤中表达量大幅下降甚至消失,除此之外EWI-2本身也与脑肿瘤患者的预后密切相关。第一部分EWI-2对肿瘤细胞表面蛋白表达及细胞运动性的调节[研究目的]探讨EWI-2是否能够调节肿瘤细胞表面蛋白的表达,分子构成以及进而调节肿瘤细胞的运动性。[研究方法]本节实验利用两种细胞株进行研究:PC3人源前列腺癌细胞株和U87人源胶质瘤细胞株。在PC3细胞株中利用SiRNA干扰沉默PC3细胞株中EWI-2的表达,基因沉默组命名为PC3-KD,同时设阴性对照组命名为PC3-NEG。在人源性胶质瘤细胞株U87构建稳定过表达EWI-2的U87-WT,与此同时设立不表达EWI-2的对照组U87-MOCK以及蛋白质棕榈化突变对照组U87-M3。EWI-2过表达和基因沉默组都用不同抗tetraspanin和抗整合素的一抗孵育,然后用偶联了荧光素的二抗孵育,接连经由流式分析仪分析。流式结果分析在Flowjo 7.6.1软件中进行,统计学数据分析利用SPSS 13.0软件:（1）PC3-NEG和PC3-KD两组数据之间各个抗体免疫荧光染色后流式分析荧光强度值比较采用独立样本t检验（Independent-Samples t test）;（2）U87三组数据之间各个抗体免疫荧光染色后流式分析荧光强度值比较采用单因素的方差分析（One-Way Anova）,数据间两两比较采用LSD方法。肿瘤细胞的运动性分析包括:伤口愈合实验,细胞迁移以及细胞侵入实验组成。对于肿瘤细胞伤口愈合实验,于六孔板中培养PC3前列腺癌细胞并用SiRNA进行EWI-2基因沉默。细胞接触抑制后,经由丝裂霉素C处理,然后用200-p枪头制造伤口。在16-24个小时的愈合过程中,伤口愈合情况用倒置显微镜观察并拍照。图像结果分析用Image J软件进行。PC3 EWI-2 RNA干扰细胞的肿瘤迁移及侵入实验都在traswell小室中进行。肿瘤细胞迁移实验中Transwell小室的聚碳酸酯膜预先用纤维粘连蛋白或者Ⅰ型层粘连蛋白包被,然后由加热失活的BSA封闭。用300u 1 DMEM/BSA重悬6000个细胞加入到transwell的小室中,在37℃、5%CO2情况下孵育三到六小时。分组比较:（1）纤维粘连蛋白（Fibronectin）包被时PC3-NEG和PC3-KD迁移的细胞数差异;（2）Ⅰ型层粘连蛋白（Laminin Ⅰ）包被时PC3-NEG和PC3-KD迁移的细胞数差异)。肿瘤侵入实验预先需要在transwell上层小室中加入Metrigel形成一层薄胶膜,然后用完全培养基重悬105细胞轻轻加入到胶膜上方。细胞迁移实验需在37℃、5%CO2条件下过夜培养。实验结束后迁移或者侵入到聚碳酸酯膜上的细胞用Diff-Quick试剂盒固定,染色,细胞拍照后用ImageJ软件进行细胞计数。统计学数据分析利用SPSS 13.0软件,在上述分组条件下,PC3两组数据之间迁移或者侵入到聚碳酸酯膜上的细胞个数比较采用独立样本t检验（Independent-Samples t test）。[实验结果]EWI-2基因沉默可以显著降低PC3细胞中同源二聚体CD9的表达（PC3-NEG=1919.67 ± 23.674,n=3;PC3-KD=1349.00 ± 75.408,n=3;P=0.002）。C9BB抗体结合量/MAB7抗体结合量比值即二聚体CD9/总CD9的比值伴随EWI-2的沉默而下调,CD9表达型倾向于单体型,而且在U87 EWI-2过表达组中也观察到了同样的趋势。然而,CD81作为EWI-2的直接偶联蛋白却没有发生表达水平的变化（P>0.05）。与此同时,EWI-2的下调可以显著降低层粘连蛋白受体α6整合素的表达（PC3-NEG=1498±22.51666,n=3;PC3-KD=1016±52.20153,n=3;P=0.001）,但是却显著上调纤维粘连蛋白受体α 5的膜表面含量（PC3-NEG=9.5667 ± 0.74923,n=3;PC3-KD=15.2433 ± 0.09171,n=3;P=0.002）。在后续的细胞-细胞外间质粘附实验中将继续探讨其机制。接着继续检测了 U87-EWI-2过表达体系对细胞表面蛋白表达的影响。EWI-2过表达（U87-WT）可以上调二聚体CD9的表达量（U87-MOCK=1164.6667±240.00162,n=3;U87-WT=2704±488.42024,n=3;P=0.017）,但是此表达却在M3 突变体中相对 WT 组却有所降低（U87-MOCK=1164.6667±240.00162,n=3;U87-M3=1068.6667±183.43603,n=3;P=0.013）。本实验中,U87-M3突变体中相对于-WT（U87-WT=14.8067± 1.33834,n=3;U87-M3=29.19±4.67339,n=3;P=0.034）和-MOCK（U87-MOCK=6.5733±0.56972,n=3;U87-M3=29.19±4.67339,n=3;P=0.004）观察到了显著的CD82上调。与基因沉默组相一致的是,CD151的表达量相对于U87-MOCK,在U87-WT中有降低的趋势（U87-MOCK=3.46333±0.14051,n=3;U87-WT=2.12±0.42548,n=3;P=0.044）,而 U87-M3 突变体相对于-WT却有所上调（U87-WT=2.12±0.42548,n=3;U87-M3=4.31±0.46608,n=3;P=0.006）。相反的是,α 6整合素的膜表面表达量伴随EWI-2的过表达有所降低（U87-MOCK=3.46±0.51481,n=3;U87-WT=1.4333±0.23681,n=3;P=0.030）但在M3突变体中α 6整合素的含量相对于-MOCK（U87-MOCK=3.46±0.51481,n=3;U87-M3=3.5422±0.67097,n=3;P=0.019）和-WT（U87-WT=1.4333±0.23681,n=3;U87-M3=3.5422±0.67097,n=3;P=0.001）却有大幅上升,整合素 α5 的表达在U87-MOCK和U87-WT中没有显著性差异（P>0.05）,我们只观察到了 U87-M3突变体中相对 MOCK 升高的 α5 表达（U87-MOCK=12.22±2.75308,n=3;U87-M3=21.2133±2.0.3850,n=3;P=0.045）。α2整合素在U87-WT组中相对于MOCK（U87-MOCK=14.6567±0.92726,n=3;U87-WT=19.8033 ±2.04452,n=3;P=0.036）和 M3（U87-MOCK=14.6567±0.92726,n=3;U87-M3=11.7133±0.66519,n=3;P=0.045）都有所上调。CD44的表达量与基因沉默组相符,在各组间无显著性差异（P>0.05）。在肿瘤细胞移动方面的研究表明,EWI-2基因沉默并不能改变伤口愈合实验的细胞迁移速度。细胞迁移到纤维粘连蛋白上的数量在PC3基因沉默组有所升高（PC3-NEG=278.3333 ±34.16789,n=3;PC3-KD=546.3333 ±48.75904,n=3;P=0.011）,相反的是我们观察到细胞迁移在层粘连蛋白中有下降的趋势（PC3-NEG=626.6667 ± 32.31271,n=3;PC3-KD=522.6667 ± 8.64741,n=3;P=0.036）,而且此趋势与细胞-细胞外基质粘附实验结果相一致。侵袭实验表明EWI-2基因沉默后,相对比阴性对照组,肿瘤细胞的侵袭能力显著上升（PC3-NEG=186± 46.92902,n=3;PC3-KD=970.6667± 87.15785,n=3;P=0.001）。有报道表明,EWI-2是通过CD82/KAII来调节肿瘤的侵袭性,但是PC3细胞株中CD82的表达量极低,所以我们推测EWI-2在PC3前列腺细胞中对于肿瘤侵袭的抑制可能来源于其他机制而非通过CD82的表达量的变化,这一点将在后续的实验中继续探讨。[实验结论]（1）EWI-2可以调节肿瘤细胞表面的蛋白表达水平。（2）可以改变细胞膜表面CD9的分子构成。（3）进而影响肿瘤细胞的运动性。第二部分EWI-2对于肿瘤细胞形态学改变,微突触的形成以及细胞粘附的作用[实验目的]肿瘤细胞迁移受多种因素的调节,如生长因子、趋化因子、基质降解酶以及细胞-细胞外基质分子等。EWI-2在细胞间微突触上有所表达并且作为癌症抑制蛋白存在。本研究中,我们利用EWI-2在U87神经胶质瘤细胞株中的过表达和PC3前列腺癌细胞中的基因沉默来共同探讨EWI-2在细胞间微突触形成和细胞粘附中所起到的作用。[实验方法]本实验利用两种细胞株进行研究:PC3人源前列腺癌细胞株和U87人源胶质瘤细胞株。在PC3细胞株中利用SiRNA干扰沉默PC3细胞株中EWI-2的表达,基因沉默组命名为PC3-KD,同时设立阴性对照组命名为PC3-NEG。在人源性胶质瘤细胞株U87构建稳定过表达EWI-2的U87-WT,与此同时设立不表达EWI-2的对照组U87-MOCK以及蛋白质棕榈化突变对照组U87-M3。两组不同细胞株都用细胞粘附相关抗体染色,如CD9,CD81,CD44等,并经由免疫荧光显微镜观察拍照。在图像分析方面,应用软件Image J和Carl Zeiss ZEN lite software分析并统计了细胞-细胞间拉链结构的形成,计算其条数,并且进行了细胞形态学差异的分析。统计学数据分析用SPSS 13.0软件中进行:（1）PC3两组间拉链结构形成的比值差异（拉链结构个数/细胞总数（%））分析采用独立样本t检验（Independent-Samples t test）;（2）PC3两组间单个细胞周围微突触形成的条数比较采用独立样本t检验（Independent-Samples t test）;（3）PC3两组间细胞形态的差异（偏圆形细胞数,偏梭型细胞数）比较采用X2检验;（4）U87三组细胞间微突触形成的长度差异比较,数量差异比较都采用单因素方差分析（One way Anova）,数据间两两比较采用LSD方法。细胞-细胞间粘附分析我们利用了单个液滴悬垂细胞聚集实验,采用PC3细胞为研究对象。PC3细胞在EWI-2基因沉默后,单个液滴悬液中的细胞在孵箱中过夜进行聚集。实验分为两组:无药物处理组和Y27632药物处理组,各组内分别设立钙离子存在及钙离子不存在培养条件（只进行组内比较,即（1）钙离子存在时无药物处理条件下PC3-NEG和PC3-KD进行比;（2）钙离子不存在时无药物处理条件下PC3-NEG和PC3-KD进行比较;（3）钙离子存在时Y27632药物处理条件下PC3-NEG和PC3-KD进行比较;（4）钙离子不存在时Y27632药物处理条件下PC3-NEG和PC3-KD进行比较。无药物处理组和药物处理组间不进行组间比较）。次日,细胞经过机械力冲击后进行拍照。在细胞团大小的统计方面,应用Image J软件进行量取和计数,实验结果以细胞团的大小显示。实验结果统计基于三次重复实验,统计学数据分析用SPSS 13.0软件进行,上述分组条件下细胞团大小差异比较应用两个独立样本的t检验（Independent-Samples t test）。继而进一步利用DU145作为模型来研究EWI-2基因沉默对β-catenin和E-cadherin定位的影响。DU145细胞基因沉默组命名为DU145-KD,同时设立阴性对照组DU145-NEG。Western blot和免疫荧光染色如上所述,影像学信息的采集我们使用Leica SP2 MP共聚焦荧光显微镜,63x Plan AP0 1.4 NA油镜观察并拍照。影像学分析采用Image J软件。统计学数据分析用SPSS 13.0软件进行,DU145两组间具有β-catenin胞内染色的细胞比例（%）差异比较应用两个独立样本的 t 检验（Independent-Samples t test）。对于细胞-细胞外基质粘附分析,选用PC3细胞作为研究对象,分别用纤维粘连蛋白和Ⅰ型层粘连蛋白预先包被96孔板,各组内分别设立钙离子存在及钙离子不存在培养条件（分组情况:（1）钙离子存在,纤维粘连蛋白（Fibronectin）包被时PC3-NEG和PC3-KD粘附的细胞数差异;（2）钙离子不存在,纤维粘连蛋白（Fibronectin）包被时PC3-NEG和PC3-KD粘附的细胞数差异;（3）钙离子存在,Ⅰ型层粘连蛋白（Laminin I）包被时PC3-NEG和PC3-KD粘附的细胞数差异;（4）钙离子不存在,Ⅰ型层粘连蛋白（Laminin Ⅰ）包被时PC3-NEG和PC3-KD粘附的细胞数差异）。EWI-2基因沉默后将细胞悬液加入到预包被的孔中进行一小时的粘附,随后轻轻用DMEM清洗96孔板三次以去掉未贴壁的细胞。贴壁细胞用Diff-Quick试剂盒染色并拍照计数。Image J软件中进行细胞计数后统计学数据分析用SPSS 13.0软件进行。实验结果的统计基于三次重复试验,上述分组条件下各组粘附的细胞数差异比较应用两个独立样本的t检验（Independent-Samples t test）。[实验结果]PC3细胞中EWI-2基因沉默可以使细胞从偏圆形形态转变成长梭形形态。PC3-NEGATIVE组中细胞微突触的形成更加平滑、规则,但是EWI-2基因沉默组中的微突触则非常容易断裂。统计结果基于三次重复实验,PC3-KD组中细胞间微突触的形成大幅降低（PC3-NEG=117.2±7.23080,n=10;PC3-KD=52±5.43446,n=10;P=0.000）,PC3-KD 组中长梭形细胞的比例占 82.9%,与 PC3-NEG组形成梭形细胞所占17.2%相比,数量显著增加（PC3-NEG=82.8%,n=233;PC3-KD=17.1%,n=175;N=3;P=0.000）,而且PC3-KD组细胞间拉链结构的形成比例（10%）相对比于PC3-NEG组（52.5%）也有显著性降低（PC3-NEG=52.5%,n=284;PC3-KD=10.0%,n=230;P=0.000）。综上实验结果说明EWI-2可以改变细胞表面微突触的长度和数量并进而影响细胞间连接的形成。继而发现,无论用何种抗体对U87组细胞进行染色,U87-M3突变体细胞与-MOCK组相比总会有更多的细胞表面微突触形成（多重比较P<O.05）。U87-WT组中从统计图来看虽然相对MOCK组有数量增多的趋势,却没有显示出统计学的显著性差异（P>0.05）。然后量取分析了微突触的长度,发现U87-WT组在CD9染色时相对比-MOCK（U87-MOCK=7.3267 ± 0.58015,U87-WT=10.3061 ± 0.77284;P=0.002）和-M3（U87-WT=10.3061 ± 0.77284,U87-M3=8.0238 ± 0.60308;P=0.024）显示出较长的微突触形成,但是在CD81染色时,-M3与-WT之间的显著性差异消失（U87-WT=15.7525 ± 8.97587,U87-M3=13.2460 ± 6.82862;P>0.05）,但是-MOCK与-WT组之间仍然具有显著性差异即-WT组有更长的微突触形成（U87-MOCK=9.0660 ± 0.80704,U87-WT=15.7525 ± 8.97587;P=0.013）。在接下来的鬼丙环肽染色分析中,我们观察到,无论在长度还是数量上,-MOCK组显示出最短以及最少的微突触形成,而-M3组具有最长和最多的微突触形成（多重比较P<O.05）。细胞-细胞间粘附实验也说明EWI-2可以功能性影响细胞粘附并且进而影响细胞的运动性。无药物处理组实验表明,经过外力冲击后,钙离子依赖组和非钙离子依赖组在EWI-2基因沉默后细胞团大小相对于阴性对照组都有显著降低（钙离子依赖组:PC3-NEG=115.2859 ± 7.37516,n=25;PC3-KD=89.7471 ±5.85023,n=23;P=0.003;非钙离子依赖组:PC3-NEG=133.4103±8.42085,n=27;PC3-KD=86.8984±3.33575,n=23）,而且还观察到EWI-2基因沉默后该组细胞有更多的单个细胞存在。继而用Y27632处理细胞,实验结果显示在药物处理后,钙离子依赖组的细胞团大小在阴性对照组和基因沉默组中的差异消失（PC3-NEG=136.3948±7.01654,n=15;PC3-KD=126.0439±11.71461,n=15,P>0.05）,而细胞团大小的差异在非钙离子依赖组中依然存在（PC3-NEG=157.9326 ±9.427704,n=16;PC3-KD=116.6084 ±7.96081,n=15,P=0.002）。DU145细胞在EWI-2基因沉默后,Western blot结果显示β-batenin表达量显著上调。随后利用β-batenin和E-cadherin抗体进行荧光染色,结果显示DU145-KD组的细胞骨架有更多结节形成,而且β-batenin有大量的细胞质内染色。然后将具有细胞质内β-batenin染色的两组细胞都进行了计数,统计结果显示DU145-KD组的β-batenin胞内染色细胞数目比例要高于阴性对照组（DU145-NEG=0.11412 ± 0.023446,n=6;DU145-KD=0.29950 ± 0.038099,n=6;P=0.002）。与此同时E-cadherin的细胞间连接染色也显著降低。细胞-细胞外基质粘附实验表明,PC3-KD组相对于阴性对照组有更多的细胞粘附在预先结合了纤维粘连蛋白的96孔板上（PC3-NEG=253.4444±54.91815,n=9;PC3-KD=446.8889±52.32390,n=9;P=0.021）,但 PC3-KD 组在预先结合了层粘连蛋白的96孔板中相对于阴性对照组却有较少的细胞粘附（PC3-NEG=712±123.08913,n=6;PC3-KD=315.16679±38.82990,n=6;P=0.012）。[实验结论]（2）EWI-2对于肿瘤细胞运动性的调节至少部分归因于细胞微突触的形成及细胞形态的变化。（2）EWI-2作为IgSF超家族成员可以调节Ca2+依赖条件下以及非Ca2+依赖条件下细胞-细胞间的粘附。ROCK抑制剂并不能影响非Ca2+依赖条件下细胞-细胞间的粘附。而且EWI-2对细胞-细胞外基质粘附的调节受ECM和整合素的影响。第三部分EWI-2对间充质细胞向阿米巴样细胞的转变的影响[研究目的]探讨EWI-2是否能够调节间充质细胞向阿米巴样细胞的转变。[研究方法]TEM实验选用PC3细胞为研究对象,在PC3细胞株中利用siRNA干扰沉默PC3细胞株中EWI-2的表达,基因沉默组命名为PC3-KD,同时设阴性对照组命名为PC3-NEG,在EWI-2基因沉默后用透射电镜分析。贴壁细胞经EDTA/PBS消化后用DMEM全培养基在冰上重悬以使微突触重新形成。四个小时悬浮培养后,细胞用甲次砷酸盐缓冲液清洗两次除掉血清,然后用2.5%戊二醛/砷酸盐缓冲液固定,细胞染色后用透射电镜观察并拍照。细胞表面泡状结构以及微突触的形成用Image J软件分析,统计学数据分析用SPSS 13.0软件进行。实验结果的统计基于三次重复试验,PC3-NEG和PC3-KD两组细胞中有细胞表面微结构的形成（具有微突触形成的细胞个数及具有细胞表面小泡形成的细胞个数）差异应用X2检验。Western blot用来分析PC3及DU145两种细胞在MAT过程中的信号转导情况。EWI-2过表达和基因沉默两组细胞都用RIPA细胞裂解液裂解,SDS-PAGE（12%）蛋白胶分离蛋白条带并电转移到硝化纤维素膜上。蛋白膜用不同一抗孵育,分别为:抗ERK、P-ERK,、PAN-ERK、VIMENTIN、FAK、PY319-FAK、EGFR、P-EGFR、tyrasinated α-tubulin、MEK1、MEK2等。随后进行HRP二抗孵育及化学显色。DU145前列腺癌细胞EWI-2基因沉默后进行三维立体培养,培养基质分为胶原蛋白和Metrigel两种。随后进行细胞形态学观察,并利用倒置显微镜观察及拍照以及后续用Image J图像处理软件分析。经形态学观察后,固定细胞,进行鬼丙环肽免疫荧光染色,染色后三维培养基质及细胞混合物用防止荧光淬灭封片剂封片保存。影像学信息的采集使用Leica SP2 MP共聚焦荧光显微镜,63x Plan APO 1.4 NA油镜观察并拍照。影像学分析采用Image J软件。统计学数据分析用SPSS 13.0软件进行。实验结果的统计基于三次重复试验,DU145-NEG和DU145-KD两组细胞中具有细胞膜小泡形成的细胞数比例（%）差异的比较应用两个独立样本的t检验（Independent-Samples t test）。酪氨酸化的微管蛋白免疫荧光染色同第二章所述。[实验结果]透射电镜分析结果显示,PC3EWI-2基因沉默后,紧随四个小时悬浮培养,EWI-2基因沉默组细胞显示出大量细胞膜泡状结构形成,而阴性对照组则有更多微突触形成（X2VALUE=17.385b,df=1,P=0.000）。在三维立体培养中发现,DU145在EWI-2基因沉默后,DU145-KD组出现了大量具有细胞膜小泡的阿米巴样细胞,相反,在阴性对照组细胞有多量的微突触形成（胶上培养:DU145-NEG=11.157±0.5982,n=3;DU145-KD=71.5±4.5369,n=3;P=0.005;胶内培养:DU145-NEG=16.180±6.7757,n=3;DU145-KD=80.233±2.3849,n=3;P=0.001）。继而进行了细胞信号转导通路的研究,Western blot结果显示无论在DU145还是PC3细胞中,EGFR/MAPK/ERK在EWI-2基因沉默过程中都被显著上调,该结果说明EWI-2基因沉默可以激活更多ERK,而EGFR、MEK1、MEK2和VIMENTIN的表达量也被上调。除了 FAK总体表达水平的下调外,FAK的自我磷酸化水平也大幅降低。而且还验证了 EWI-2基因沉默是非Src依赖性的,即Src的磷酸化水平在EWI-2基因沉默过程中没有任何变化。微管蛋白的去酪氨酸化与癌症的进展有明显的关系。本实验中,Western blot结果显示酪氨酸化的微管蛋白表达量有大幅降低,而且在免疫荧光染色中我们也观察到了 PC3-KD组有微管蛋白解聚的现象。[实验结论]（1）三维立体培养有利于阿米巴样细胞的形成并且EWI-2的基因沉默可以促进间充质细胞向阿米巴样细胞的转变。（2）ERK和FAK信号通路与EWI-2基因沉默导致的MAT相关。（3）在MAT转换过程中微管结构发生解聚。[实验不足之处]在实验过程中我们发现,PC3前列腺细胞株的细胞特性决定了细胞之间紧密连接极少,所以在针对E-cadherin和β-catenin的研究中我们必须使用具有更多上皮样细胞特性的DU145前列腺癌细胞株来进行研究。而且在后续的实验中我们还要探讨在MAT过程中阿米巴样细胞的标志性蛋白的变化情况。
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