脱氧核酶对人肝癌SMMC-7721细胞端粒酶活性的影响

论文摘要

原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,虽然其病因和发病机制尚未完全肯定,可能与多种因素的综合作用有关,但端粒酶的激活和端粒长度的稳定是细胞永生化和恶性转化改变中重要的一环。端粒（telomere）是位于真核细胞线性染色体末端、由高度保守的简单重复的DNA序列和蛋白质组成的特殊结构,对于保护染色体、防止染色体融合、降解是非常重要的。端粒酶（telomerase）是一种核蛋白,有3种亚单位成分:即人端粒酶RNA（human telomerase RNA,hTR）、端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）和端粒酶相关蛋白1（telomerase-associated protein 1,TP1）组成,近年来大量研究发现端粒酶是细胞永生化和肿瘤发生必不可少的、人体内最具肿瘤特异性和高表达的生物学标志。其中hTERT是端粒酶活性的表达亚基,它几乎存在于所有的恶性肿瘤中,hTERT的表达与端粒酶活性相一致,是端粒酶活性的决定性因素。因此,hTERT成为靶向端粒酶抗癌策略的理想靶点。据报道,89.5%的肝癌组织中可检测到端粒酶活性及其逆转录酶的表达。脱氧核酶（DNAzyme）是一种具有酶活性的DNA分子。它可以特异性地与靶RNA配对,切割靶RNA而使其失去生物学活性。目前研究最多的是“1023”型脱氧核酶（1023DNAzyme, 1023DRz）,它的结构极似锤头样核酶,含有一个高度保守的催化区和两个可变的侧翼结合区。利用反义核酸技术,人工合成靶向hTERT的1023DRz,抑制hTERTmRNA表达和端粒酶活性,诱导肿瘤细胞凋亡,是目前进行肿瘤基因治疗的方向之一。目的:本研究设计合成靶向人端粒酶催化亚基（hTERT）基因的1023DRz,观察其对肝癌SMMC-7721细胞hTERT mRNA的的胞内外切割作用,以及其对细胞的生长抑制作用和对端粒酶活性的影响,在细胞水平上探讨其成为新型治疗原发性肝癌基因药物的可能性。方法:针对人端粒酶催化亚基（hTERT）基因的核苷酸序列,合成“1023”型脱氧核酶DzTi（脱氧核酶3’末段添加倒位连接T碱基以防止遭受核酸酶降解）及其类似物DzTiscr（结构与DzTi匹配,但两底物结合臂序列打乱）,提取总RNA在体外切割hTERT mRNA后,半定量RT-PCR检测靶基因hTERT mRNA的表达;转染肝癌细胞后,用RT-PCR扩增hTERT基因片段,MTT比色分析法测定细胞增殖抑制情况;用TRAP-PCR银染法检测端粒酶活性;统计学处理采用多样本均数两两比较的方差分析。结果: 1.胞外切割后RT-PCR扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳分析显示:各组泳道中内对照β-actin扩增产物条带（592bp）的亮度相似,而hTERT扩增产物条带（222bp）的亮度DzTi组明显弱于其它两组。灰度扫描半定量结果显示,空白组、DzTi组和DzTiscr对照组SMMC-7721细胞中hTERT mRNA的相对表达量分别为0.718±0.014、0.283±0.012、0.716±0.019,q检验方差分析,DzTi组hTERT mRNA相对表达量分别与空白组及阴性对照组相比,均下降61%左右,差异有统计学意义（P<0.01）,而其它两组之间相比,无显著性差异（P>0.05）。2.转染48h后各组RT-PCR扩增产物凝胶电泳分析显示:各组泳道中内对照β-actin扩增产物条带（592bp）的亮度相似,而hTERT扩增产物条带（222bp）的亮度DzTi组明显弱于其它三组。灰度扫描半定量结果显示,空白组、脂质体组、DzTi组和DzTiscr对照组SMMC-7721细胞中hTERT mRNA的相对表达量分别为0.726±0.018、0.725±0.011、0.170±0.029、0.710±0.013,经q检验方差分析,DzTi组hTERT mRNA相对表达量分别与空白组、脂质体组、DzTiscr组相比,均下降76%左右,差异有统计学意义（P<0.01）;而其它三组之间比较,无显著性差异（P>0.05）。3. MTT比色分析法测定细胞增殖抑制率显示:在正常使用浓度和作用细胞的时间内,Lipo-DzTi组对肝癌SMMC-7721细胞的增殖有抑制作用,并具有浓度依赖性和时间依赖性;Lipo-DzTi组分别与对照组Lipo组、Lipo-DzTiscr组比较,均有显著性差异（P<0.05）,而两对照组比较,无显著差别（P>0.05）。4.转染48h后端粒酶活性,TRAP-PCR银染法检测显示:空白组、脂质体组及DzTiscr组作用48h,其TRAP产物电泳均显示明显的梯形条带,亮度深;而实验组即DzTi组,作用48h后,TRAP产物电泳显示梯形条带明显减少,亮度浅。结论:本实验设计合成的脱氧核酶能够从基因水平上高效特异地抑制人肝癌SMMC-7721细胞端粒酶hTERT mRNA的表达,降低肝癌细胞的端粒酶活性,从而抑制细胞生长。作为一种新发现的催化性核酸,脱氧核酶在肿瘤的基因治疗领域中将具有及其重要的应用价值。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 研究背景
• 1.2 研究目的
• 1.3 研究内容
• 2 脱氧核酶的设计及其对端粒酶hTERT m RNA 的胞外切割作用的研究
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 实验结果
• 3 脱氧核酶对端粒酶hTERT m RNA 的胞内切割作用的研究
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.3 实验结果
• 4 脱氧核酶及脂质体对 SMMC-7721 细胞的毒性作用
• 4.1 实验材料
• 4.2 实验方法
• 4.3 实验结果
• 5 脱氧核酶对 SMMC-7721 细胞端粒酶活性的影响
• 5.1 实验材料
• 5.2 实验方法
• 5.3 实验结果
• 6 讨论及结论
• 6.1 讨论
• 6.2 结论
• 参考文献
• 文献综述：“10～23”型脱氧核酶的研究进展
• 缩写词表
• 攻读硕士学位期间科研情况及奖励
• 致谢