不结球白菜种质资源遗传多样性的初步研究

论文摘要

不结球白菜（Brassic campestris L. ssp. Chinensis（L.） Makino）原产中国,属十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种蔬菜,是一种重要的叶菜类蔬菜。不结球白菜种质资源极其丰富,不仅数量多,而且类型复杂。然而随着生产中少数高产品种的大面积栽培,使许多地方品种和农家品种被淘汰,品种单一化和遗传脆弱化日趋严重。利用分子标记进行不结球白菜资源鉴定和分类对不结球白菜种质创新和新品种选育具有重要意义。为进一步挖掘不结球白菜遗传潜力,拓宽遗传基础,充分利用种质资源,本研究从分子水平分析了不结球白菜资源的遗传多样性。通过单因素试验和正交试验相结合成功设计并优化了不结球白菜的ISSR和SRAP技术体系。利用ISSR、RAPD和SRAP三种标记技术对96份不结球白菜资源进行了遗传多样性分析,采用Jaccard方法计算出遗传相似系数矩阵,以UPGMA法对96份不结球白菜资源进行了聚类分析,并分析了不结球白菜种群间的遗传分化。利用ISSR、RAPD和SRAP技术对2个不结球白菜组合的双亲和F1进行了引物筛选,初步建立了应用于不结球白菜亲本及其F1的指纹图谱。研究主要结果如下:1.通过单因素试验确定了Taq DNA聚合酶、dNTP、引物和Mg2+ 4种因素在不结球白菜ISSR、SRAP反应体系中的适宜浓度范围,并在此基础上利用正交试验设计,从4种因素3个水平对不结球白菜ISSR、SRAP反应体系进行了优化,确立了适合不结球白菜的ISSR、SRAP反应体系。在20μL的ISSR反应体系中,含Taq DNA聚合酶1U、dNTP 0.25mmol/L、引物0.25μmol/L、1×PCR buffer、Mg2+2.5mmol/L、模板DNA30ng。在20μl的SRAP反应体系中,含Taq DNA聚合酶1U、dNTP 0.15mmol/L、正向引物0.35μmol/L、反向引物0.35μmol/L、Mg2+ 3.5mmol/L。通过梯度PCR测验和总循环次数梯度处理,确定了适宜的ISSR反应总循环数和ISSR引物UBC822的退火温度。使用优化后的反应体系能够对7种主要的芸薹属作物进行有效的鉴别。优化体系的建立为今后利用ISSR、SRAP技术进行不结球白菜种质资源分类、遗传图谱构建和基因定位奠定了技术基础。2.利用ISSR、RAPD和SRAP三种标记对96份不结球白菜资源的DNA遗传多样性进行了分析。结果表明,SRAP在三种标记中多态性最高,RAPD次之,ISSR较低,11个SRAP引物组合、14条RAPD引物和15条ISSR引物分别检测出346、98和185个位点,其中多态性位点分别为293、71和127个,PPB分别达84.68%、72.45%和68.65%;不结球白菜各类型中以普通白菜的Shannon信息指数最高,其中又以秋冬栽培类型最高,是遗传多样性最丰富的类型。聚类结果显示,各变种类型不能被明显地分开,在RAPD标记聚类结果中尤为明显。总体上菜薹资源与普通白菜遗传距离较近,而普通白菜中的香青菜比较特殊,多数聚类到一起并同其它普通白菜区分开;对不结球白菜种群遗传多样性的分析显示,不结球白菜的遗传分化系数较低,大部分变异主要存在于种群内,标记检测出不结球白菜种群间的基因流平均水平较高,说明群体间基因交流较多,种群间遗传分化程度相对较低;另外分析还发现联合使用多种标记可有效提高对资源多样性研究的准确性。三种标记的研究结论在起到相互验证的同时,还存在互补的作用。Mantel-test检测结果也显示,三种标记检测结果间的相关性较低,说明它们分别从不同的角度反映了不结球白菜的遗传背景,综合三种标记的检测结果对不结球白菜的遗传多样性进行分析,可以更真实地反映资源间的亲缘关系,更准确全面地分析资源的遗传多样性。本研究中联合标记的使用已显示出优越性,在资源聚类分析中效果更为明显,联合标记的聚类结果比单个标记的聚类结果更有规律。试验中发现了6个资源的9个特异标记,通过对特异片段的克隆测序,成功转化一个特异标记（UBC834-206）为SCAR标记（SU834）,可以快速、特异鉴别该资源。3.利用RAPD、ISSR和SRAP三种标记技术,对由双亲及其F1组成的两个组合进行分析。结果表明有3个RAPD引物、3个ISSR引物和3对SRAP引物可扩增出“新夏青2号”双亲的互补特征带,将其双亲和F1区分出来;对“新绿”的引物筛选结果表明,有3个ISSR引物和2对SRAP引物可扩增出双亲的互补特征带,将双亲和F1区分出来。从而建立了由RAPD、ISSR和SRAP三种标记技术组成的鉴定亲本及其杂种的分子指纹图谱,并转化为数字指纹图谱,为种子纯度的鉴定开辟了新的技术途径,为新品种知识产权的保护提供了重要手段。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 文献综述
• 1 分子标记技术的分类及原理
• 1.1 基于DNA 杂交的分子标记
• 1.1.1 限制性片段长度多态性
• 1.1.2 小卫星DNA
• 1.2 基于PCR 技术的分子标记
• 1.2.1 随机扩增片段长度多态性DNA
• 1.2.2 简单重复序列
• 1.2.3 简单重复序列间区扩增
• 1.2.4 序列相关扩增多态性
• 1.2.5 靶位区域扩增多态性
• 1.3 基于限制性酶切和PCR 技术的分子标记
• 1.3.1 扩增片段长度多态性
• 1.3.2 酶切扩增多态性序列
• 2 分子标记技术在作物育种中的应用
• 2.1 遗传连锁图谱的构建
• 2.2 种质资源鉴定和遗传背景分析
• 2.3 品种、品系鉴定和杂交种纯度分析
• 2.4 基因标记及分子标记辅助选择育种
• 3 研究现状
• 3.1 分子标记技术在不结球白菜资源遗传多样性中的应用
• 3.1.1 不结球白菜资源分类的研究进展
• 3.1.2 分子标记技术在不结球白菜资源遗传多样性中的应用
• 3.2 DNA 指纹图谱在不结球白菜品种鉴定中的应用
• 4 研究目的和意义
• 第一章 ISSR、SRAP 反应条件的优化及初步应用
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 试剂与仪器
• 1.3 DNA 的提取及检测
• 1.4 ISSR 反应条件和程序的优化
• 1.4.1 ISSR 扩增反应单因素筛选
• 1.4.2 正交试验优化ISSR-PCR 体系
• 1.4.3 退火温度及循环次数的确定
• 1.5 SRAP 反应体系的优化
• 1.5.1 SRAP 反应单因素筛选
• 1.5.2 正交试验优化SRAP-PCR 体系
• 1.6 优化体系的初步应用
• 2 结果与分析
• 2.1 ISSR 反应和程序的优化
• 2.1.1 ISSR 扩增反应单因素筛选
• 2.1.2 ISSR-PCR 正交试验设计的直观分析
• 2.1.3 退火温度及循环次数的确定
• 2.2 SRAP 反应体系的优化
• 2.2.1 单因素试验优化SRAP 反应体系
• 2.2.2 SRAP-PCR 正交试验设计的直观分析
• 2.3 优化体系的初步应用
• 3 讨论
• 第二章 不结球白菜资源遗传多样性的 ISSR、RAPD、SRAP 分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 DNA 的提取及检测
• 1.2.2 PCR 扩增及产物检测
• 1.2.3 引物筛选
• 1.3 数据统计与分析
• 1.3.1 建立0、1 数据库
• 1.3.2 聚类方法比较和选择
• 1.3.3 数据分析
• 1.4 特异片段回收、测序及引物设计
• 2 结果与分析
• 2.1 聚类方法比较和选择
• 2.2 ISSR 扩增结果分析
• 2.2.1 不结球白菜ISSR 引物扩增多态性分析
• 2.2.2 不同类型不结球白菜ISSR 遗传多样性
• 2.2.3 不结球白菜的ISSR 聚类分析
• 2.2.4 不结球白菜ISSR 遗传分化
• 2.3 RAPD 扩增结果分析
• 2.3.1 多态性分析
• 2.3.2 不同类型不结球白菜RAPD 遗传多样性
• 2.3.3 不结球白菜的RAPD 聚类分析
• 2.3.4 不结球白菜RAPD 遗传分化
• 2.4 SRAP 扩增结果分析
• 2.4.1 多态性分析
• 2.4.2 不同类型不结球白菜SRAP 遗传多样性
• 2.4.3 不结球白菜的SRAP 聚类分析
• 2.4.4 不结球白菜的SRAP 遗传分化
• 2.5 不结球白菜的ISSR-RAPD-SRAP 联合标记分析
• 2.5.1 各类型不结球白菜ISSR-RAPD-SRAP 联合标记遗传多样性分析
• 2.5.2 不结球白菜的ISSR-RAPD-SRAP 联合标记聚类分析
• 2.5.3 不结球白菜的ISSR-RAPD-SRAP 联合标记遗传分化
• 2.6 特异标记的SCAR 转化
• 3 讨论
• 第三章 RAPD、ISSR、SRAP 技术构建不结球白菜杂种指纹图谱
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 DNA 的提取及检测
• 1.2.2 PCR 扩增及产物检测
• 2 结果分析
• 2.1 引物筛选
• 2.2 扩增结果分析
• 2.3 数字指纹的建立
• 3 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间参与论文发表情况