论文摘要
目的：制备低分化甲状腺癌（poorly differentiated thyroid carcinoma, PDTC）细胞模型,研究BCl2抗凋亡作用的机制及siRNA-BC12在PDTC细胞中的促凋亡作用,观察siRNA-BC12与碘联合应用在PDTC细胞中的作用,初步探讨siRNA干扰BC12表达用于PDTC治疗的可行性,期望能为低分化甲状腺癌的靶向治疗提供新的靶点。方法1. PDTC田胞模型的制备及鉴定用低剂量碘辐射滤泡状甲状腺癌FTC-133细胞系,分别于0h、2h、8h、24h和48h后更换正常培养基继续培养6h,用γ计数仪测定细胞的放射性计数,筛选细胞放射性计数下降最多的辐射时间为最佳时间。用Western Blot的方法检测最佳辐射时间点的细胞碘作用后甲状腺特征性蛋白NIS、TPO、TSHR的表达变化,从而评价细胞分化程度；用平板克隆形成试验评价FTC-133细胞经碘作用一定时间后增殖能力的变化。2. BCL2调节细胞凋亡及siRNA-BCL2促进PDTC田胞凋亡的初步研究构建pcDNA3.1-BC12质粒,转染B35细胞系,制备稳定表达BCl2的细胞系。用BC12抗体和内质网特异性抗体进行免疫荧光染色,用激光共聚焦显微镜观察BC12在细胞内表达的定位情况。将稳定表达BCl2的B35细胞经糖氧剥夺（oxygen glucose deprivation, OGD）处理,在激光共聚焦显微镜下观察细胞色素C的表达变化及细胞内分布情况；用Western Blot的方法检测OGD作用后细胞内凋亡下游蛋白Caspase3的表达变化；用LDH试剂盒检测细胞活性的变化。化学合成siRNA-BCL2和siRNA-NC,体外转染PDTC细胞,从mRNA水平和蛋白水平评价siRNA沉默细胞内BCL2表达的效率。PDTC细胞经OGD作用后,检测细胞内凋亡下游蛋白Caspase3的表达变化及LDH含量变化,评价siRNA-BCL2促进PDTC细胞凋亡的作用。3. siRNA-BCL2转染联合’。’碘辐射在PDTC田胞中的作用研究PDTC细胞中siRNA-BCL2和131碘联合应用的实验分四组：双阴性组（转染siRNA-NC,无131碘辐射）、siRNA-BCL2单独应用组（转染siRNA-BCL2,无131碘辐射）、131碘单独应用组（转染siRNA-NC,有131碘辐射）和联合应用组（转染siRNA-BCL2,有131碘辐射）。PDTC细胞转染siRNA-BCL2或siRNA-NC24h后,加入131碘（每个35mm培养板加入60μCi131碘）作用20min后,转入正常培养环境中常规培养。6h后,用γ计数仪测定双阴性组和siRNA-BCL2单独应用组摄碘能力：用Western Blot检测细胞内凋亡下游蛋白Caspase3的表达,用LDH试剂盒测定LDH含量,用流式细胞仪AnexinV/PI双染法测定四组PDTC细胞的凋亡率。结果1. PDTC细胞模型的制备及鉴定低剂量的’3。碘辐射FTC-133后细胞摄碘能力下降,且在48h内随时间延长呈逐渐下降趋势,48h辐射后细胞摄碘能力最低,甲状腺特征性蛋白表达明显下降,细胞增殖能力增强,即PDTC制备成功。FTC-133细胞经20μCi的131碘辐射2h、8h、24h和48h,继续培养6h后,细胞放射性计数与未辐射组比较分别是97.4±6.2%（2h）、78.0i7.0%（8h）、67.1±9.1%（24h）和48.0±1.2%（48h）。Western Blot检测131碘辐射48h后的FTC-133细胞甲状腺特征性蛋白TSHR、TPO、NIS的表达均降低,相对于内参β-actin的表达量分别是0.31±0.08、0.35±0.06、0.22±0.09,而对照组表达量分别是0.40±0.08、0.47±0.09、0.31±0.09,经SPSS17.0统计分析,TSHR、TPO、NIS的值分别是9.49,6.48,4.42,p值均＜0.05。平板克隆形成试验结果显示,辐射48h组细胞培养2w后克隆形成率为95±3%,对照组克隆形成率为87±4%,经SPSS17.0软件进行配对t检验分析,t=2.85,p=0.02（p＜0.05）,结果有统计学差异。2. BCL2调节细胞凋亡及siRNA-BCL2促进PDTC细胞凋亡的初步研究B35细胞系稳定转染pcDNA3.1-BC12质粒后高表达BCL2,相对表达量为1.50±0.18,而阴性对照组仅为0.23±0.07,两者有统计学差异（p＜0.05）。BCL2转染入细胞后在内质网定位并表达,BCL2单克隆抗体和内质网特异性抗体PDI免疫荧光染色后用激光共聚焦显微镜观察,同一个视野下用不同波长的激发光照相后同机融合,显示BCL2抗体染色和PDI抗体染色融合良好。BCL2在B35细胞中抑制凋亡。稳定表达BCL2的B35细胞和阴性对照组细胞经8h OGD作用后,恢复正常培养条件下常规培养18h,Cyto C免疫荧光染色后激光共聚焦显微镜下观察,显示细胞形态完整,但细胞内Cyto C染色增多,而对照组细胞出现典型的凋亡形态学改变；Western Blot结果显示稳定表达BCL2的细胞凋亡下游蛋白Caspase3表达较对照组少,稳定表达组Caspase3相对于内参β-actin的表达量是0.37±0.16,而阴性对照组的相对表达量是0.68±0.12,两者经SPSS17.0配对t检验p＜0.05,两者有统计学差异。LDH浓度结果显示稳定表达组比阴性对照组培养基LDH浓度低,分别为38.014±1.98%和50.42±5.89%,经SPSS17.0配对检验,t=5.28,p=0.003（p＜0.05）,差异有统计学意义。从：mRNA水平和蛋白水平都发现,siRNA-BCL2转染PDTC细胞后有效抑制BCL2的表达。Real time PCR检测显示转染siRNA-NC的细胞BCL2mRNA的表达量是转染siRNA-BCL2的5.014±0.39倍；Western Blot检测显示转染siRNA-BCL2组BCL2蛋白的相对表达量是0.11±0.06,而转染siRNA-NC组的相对表达量是0.22±0.08,两者比较有统计学差异（p<0.05）。siRNA-BCL2在PDTC细胞中促进OGD引起的细胞凋亡。转染siRNA-BCL2组和转染siRNA-NC组细胞经OGD作用后,前者Caspase3相对表达量是0.73±0.15,后者是0.44±0.07,前者细胞培养基中LDH含量是4.94±1.30,后者是3.47±0.78,均有统计学差异（p<0.05）。3. siRNA-BCL2转染联合‘。1碘辐射在PDTC田胞中的作用研究转染siRNA-BCL2后PDTC细胞摄碘能力无明显变化。转染siRNA-BCL2组和转染siRNA-NC组与空白对照组细胞放射性计数比值分别是98.224±4.13%和97.564±6.81%,两者比较无统计学差异（t=-0.145,p=0.89）。转染siRNA-BCL2组和转染siRNA-NC组比较,前者PDTC细胞凋亡加速。在相同剂量相同时间的131碘辐射作用下,前者凋亡下游蛋白Caspase3相对表达量是0.854±0.09,后者是0.544±0.14,两组比较差异有统计学意义（t=3.47,p=0.018）；前者LDH含量是4.32±0.54,后者是2.54±0.35,两组的差异有统计学意义（t=7.16,p=0.001）。siRNA-BCL2转染与’。’碘联合应用在PDTC细胞中有协同杀伤作用。流式细胞仪检测细胞凋亡率实验显示空白对照组凋亡率是41.70±7.49%;转染siRNA-BCI2和131碘辐射单独应用均促进PDTC细胞凋亡,凋亡率分别是49.46±7.88%和69.28±8.98%；siRNA-BCL2和131碘联合作用PDTC细胞凋亡率是85.86±10.04%,凋亡程度高于siRNA-BCL2和131碘单独应用组；转染siRNA-BCL2组加131碘辐射后凋亡率的增加值较转染siRNA-NC组加131碘辐射后凋亡率的增加值高；以上各组比较均有统计学差异（p均小于0.05）。结论1.采用低剂量的131碘辐射分化型甲状腺癌细胞系的方法制备的PDTC模型,从某种程度上模拟了131碘治疗过程中甲状腺癌失分化的过程,且在甲状腺特征性蛋白的表达和增殖能力上都符合甲状腺癌向失分化方向发展的特征,是甲状腺癌失分化过程的中间体。2. BCL2在凋亡过程中起抵抗作用,可能是通过内质网应激途径激活的；siRNA-BCL在PDTC细胞中可以有效的抑制BCL2的表达,促进OGD引起的细胞凋亡,BCL2基因有望成为低分化甲状腺癌分子治疗的新靶点。3. siRNA-BCL2和131碘均能促进PDTC细胞的凋亡,且两者联合应用有协同作用,原因可能是siRNA-BCL2促进了PDTC细胞对射线的敏感性,与细胞的摄碘能力无关,推测siRNA抑制BCL2表达有可能对低分化甲状腺癌的靶向治疗有效。