驱动蛋白Kif2a在乳腺癌中表达的临床意义及功能研究

论文摘要

乳腺癌是严重威胁世界女性健康的恶性肿瘤,其发病率逐年增加,据统计2008年,美国40,000女性死于乳腺癌。在亚洲和许多发展中国家,女性乳腺癌的发病率逐年增加。乳腺癌已经成为东南亚女性死亡的主要原因,乳腺癌是年龄在40-79岁之间的女性死亡的最主要原因。在东亚女性中,已经成为仅次于胃癌的第二大恶性肿瘤。在我国,乳腺癌的发病率和死亡率呈明显上升趋势,并且上升的速度已经超过了世界平均上升速度。在中国的部分城市如北京、上海等地方,乳腺癌已经成为女性死亡率最高的疾病,而乳腺癌的发病原因至今仍不十分明确。20世纪90年代人们发现了微管驱动蛋白,这些蛋白在细胞内转运、分裂和双极纺锤体形成中有极其重要的作用。最近发现,某些驱动蛋白与肿瘤发生、发展有关。驱动蛋白-13家族中Kif2c/MCAK与肿瘤的关系已有报道,但驱动蛋白Kif2a在乳腺癌的发生、发展中的作用及与预后的关系至今尚无研究报道。本课题分为三部分,从不同方面分别对Kif2a与乳腺癌的关系进行研究：第一部分驱动蛋白Kif2a在乳腺癌中表达的临床意义研究目的通过检测驱动蛋白Kif2a及其mRNA在乳腺癌和癌旁组织中的表达情况,探讨Kif2a与乳腺癌临床病理特点的关系,为探索Kif2a与乳腺癌发生、发展及预后的关系提供参考。研究方法1.病例资料收集以1997和2009年间在山东大学齐鲁医院乳腺外科接受乳腺癌根治术或改良根治术的116例原发性乳腺癌病人作为研究对象（1997年60例,2009年56例）。本组116例病人均为女性,发病年龄20-65岁,中位年龄45岁,所有病例术前均未接受放射治疗、化疗以及内分泌治疗。1997年手术的60例病例随访时间超过10年。2.免疫组化染色对116例乳腺癌和癌旁组织进行Kif2a常规免疫组化染色。结果分析采用改良的Harvey评分标准。3. Real time RT-PCR检测在留取乳腺癌和癌旁组织做石蜡包埋的同时,分别各取部分新鲜的癌和癌旁组织迅速放入-196℃液氮中保存,统一提取总RNA,进行逆转录和DNA扩增,检测mRNA表达情况。4.统计学分析用SPSS16.0统计软件包进行统计学数据分析,数据以均数±标准差表示,两均数间比较采用t检验。用log-rank检验分析Kif2a表达与生存时间的关系,P<0.05为有显著性差异。结果1. Kif2a在原发乳腺癌组织中表达高于癌旁组织驱动蛋白Kif2a免疫组化染色定位于肿瘤细胞浆和细胞核中,68.2%的病例中乳腺癌细胞Kif2a表达高于癌旁组织上皮细胞,评分分别为7.0517±0.74419和6.2931±0.97817,原发癌组织与癌旁组织表达水平在统计学上有显著差异（p<0.05）2.乳腺癌组织中Kif2a的mRNA表达高于癌旁组织检测4对原发癌和癌旁组织中Kif2a的mRNA,同时检测癌和癌旁组织蛋白水平的表达,结果显示：原发癌组织中Kif2a的mRNA表达水平高于癌旁组织,与免疫组化检测的原发癌和癌旁组织Kif2a蛋白表达结果一致。3. Kif2a在乳腺癌组织中过表达与临床病理特点的相关性本组116例病人中,原发癌组织中Kif2a表达水平与腋窝淋巴结转移有关,腋窝淋巴结转移和无腋窝淋巴结转移患者的原发癌组织中Kif2a的表达评分分别为：7.3043±0.6486和6.6809±0.7255,腋窝淋巴结转移患者的原发癌组织中Kif2a表达高于腋窝淋巴结无转移患者（P<0.05）。但是,Kif2a的表达水平与病人的年龄、肿瘤大小、病理学分期无关（P>0.05）。4.乳腺癌组织中Kif2a的表达水平与病人生存率相关本组116例乳腺癌病人中,60例病人的随访时间超过10年。随访结果显示：Kif2a的表达与患者预后有关。Kif2a蛋白高表达病人的10年生存率是51.1%,低表达的生存率是93.3%,高表达与低表达两组之间的生存率有显著差异（P<0.05）。乳腺癌伴有肝脏、肺脏或骨转移的患者,原发癌组织中Kif2a的评分都较高。结论1.乳腺癌组织中的Kif2a在mRNA和蛋白水平上的表达均高于相应癌旁组织中的表达。2.乳腺癌组织中Kif2a蛋白的表达与病人的年龄、病理学组织分级、肿瘤大小无关,与患者有无淋巴结转移相关,腋窝淋巴结转移患者的原发癌组织中Kif2a表达高于腋窝淋巴结无转移患者。3.乳腺癌组织中Kif2a蛋白的表达与预后相关,Kif2a高表达者生存率远低于低表达者。第二部分转染Kif2a-siRNA对乳腺癌MCF-7细胞恶性行为的影响研究目的通过siRNA干扰方法,沉默乳腺癌MCF-7细胞中的Kif2a基因,检测乳腺癌MCF-7细胞在增殖、凋亡、迁移以及侵袭能力方面的变化,探讨Kif2a在乳腺癌细胞增殖、凋亡、迁移以及侵袭中的作用,为探索以Kif2a为新靶点的乳腺癌生物靶向治疗提供参考依据。研究方法1.转染Kif2a-siRNA根据siRNA转染说明进行转染。将乳腺癌MCF-7细胞（2×105／孔）接种于6孔板中,孵育16小时后,融合率达30-50%时,将5μl Kif2a的siRNA和200цlOPTI-MEM混合,然后与5цl脂质体lipofectamine2000和200μl OPTI-MEM的混合物混匀,加入每个孔,使每孔的Kif2a剂量为50nM/2ml,在37℃,5%C02条件下培养4-6小时后,将培养基换成含10%胎牛血清的RPMI1640分别继续培养至24小时、48小时和72小时。2.MTT法检测细胞增殖抑制MTT法检测乳腺癌MCF-7细胞增殖情况。将MCF-7细胞接种于平底96孔板中（1.0×103／孔）,设空白对照组、转染无意义序列siRNA组和转染特异性Kif2a-siRNA组三组细胞,分别培养24小时、48小时和72小时。加入MTT试剂,继续孵育4小时,离心,弃上清,加入150μl DMSO上酶标仪比色,用570nm-620nm波长测光吸收值,计算抑制率。3.细胞迁移检测在孔径为8.0-μm Transwell小室下室加入600цl 10%胎牛血清RPMI1640培养液,上室加入2×104 cells/100μl细胞悬液。放置于5%CO2细胞培养箱内,37℃、饱和湿度环境下孵育16小时；甲醇固定10分钟；伊红染色剂染色；200倍光镜下,计数微孔滤膜下室面迁移的肿瘤细胞,每张膜随机计数10个视野。取平均值作为迁移细胞数量。4.细胞侵袭检测在Transwel1小室上室的底部铺Matrigel胶40цl,细胞穿孔时间延长至24小时。其他实验要求和方法同迁移实验。5.流式细胞技术检测凋亡收集空白对照组、转染无意义序列siRNA组和转染特异性Kif2a-siRNA组细胞,用100цl稀释结合缓冲液重新悬浮细胞,加5μlAnexinV/FITC和10цl（10μg/ml）碘化丙啶溶液。混匀后于室温避光孵育15min。在反应管中加400цl稀释结合缓冲液,过滤后上流式细胞仪分析。结果1.沉默Kif2a后乳腺癌MCF-7细胞增殖受抑制空白对照组、转染无意义序列siRNA组和Kif2a-siRNA组分别培养24、48和72小时,OD值分别如下,24小时：0.4198±0.0616（mock）, 0.4076±0.0439（nonsense-siRNA）,0.2864±0.0230（Kif2a-siRNA）,48小时: 0.7287±0.1318（mock）,0.7019±0.0523（nonsense-siRNA）,0.5054±0.1011 （Kif2a-SiRNA）；72小时:0.7948±0.0668（mock）,0.6689±0.0951 （nonsense-siRNA）,0.4745±0.0849（Kif2a-siRNA）.结果显示：24、48、72小时两组对照组与实验组比较,抑制率有显著性差异,均P<0.05。但24、48和72小时空白对照和转染无意义序列siRNA组间比较,无显著性差异（P>0.05）乳腺癌MCF-7细胞转染Kif2a-siRNA后,细胞增殖生长明显受抑制。2.沉默Kif2a基因乳腺癌MCF-7细胞迁移能力下降用Transwell小室,检测乳腺癌MCF-7细胞沉默Kif2a后对迁移能力的影响。16小时的迁移能力实验结果显示：与空白对照和转染无意义序列siRNA对照组相比,敲除Kif2a基因的乳腺癌MCF-7细胞迁移能力显著降低（P<0.05）,这与本研究的第一部分临床资料的研究结果相吻合,即乳腺癌患者Kif2a的高表达与患者的腋窝淋巴结转移有显著相关性。3.沉默Kif2a基因乳腺癌MCF-7细胞侵袭能力下降Transwell小室上室底部铺40μl Matrigel胶,检测沉默Kif2a后乳腺癌MCF-7细胞的侵袭能力,侵袭实验的侵袭时间为24小时。与空白对照和无意义序列siRNA对照组相比,敲除Kif2a基因的乳腺癌MCF-7细胞侵袭能力显著降低（P<0.05）,这也与本研究的第一部分临床资料的研究结果相吻合,即乳腺癌患者Kif2a的高表达与患者的腋窝淋巴结转移有显著相关性。4.沉默Kif2a基因对乳腺癌MCF-7细胞凋亡无明显影响本研究中,我们选用AnexinV／FITC法检测转染Kif2a-siRNA后24、48和72小时的晚期细胞凋亡率,流式细胞仪分析结果为24小时：6.89%±3.48%（mock）,6.91%±3.60%（Kif2a-siRNA）；48小时：9.51%±3.14%（mock）,16.65%±5.5212%（Kif2a-siRNA）:72小时：9.32%±5.34%（mock）,13.88%±5.65%（Kif2a-siRNA）.转染Kif2a-siRNA的乳腺癌细胞凋亡率与对照组比较无显著性差异（p>O.05）,未发现Kif2a-siRNA转染对乳腺癌细胞的凋亡有影响。结论1.沉默Kif2a基因后乳腺癌MCF-7细胞的增殖能力明显降低。2.沉默Kif2a基因后乳腺癌MCF-7细胞的迁移和侵袭能力明显降低。与本研究的第-部分临床资料的研究结果相吻合,即乳腺癌患者Kif2a的高表达与患者有无腋窝淋巴结转移有显著相关性。3.沉默Kif2a基因后对乳腺癌MCF-7细胞的凋亡无明显影响。第三部分驱动蛋白Kif2a与癌胚抗原黏附分子CEACAM1在乳腺癌组织中表达以及与预后的关系研究目的通过同时检测Kif2a和癌胚抗原相关细胞黏附分子1（CEACAM1）在乳腺癌和癌旁组织中的表达,探讨Kif2a与CEACAM1表达的相关性,明确驱动蛋白Kif2a与癌胚抗原相关黏附分子CEACAM1在乳腺癌中的作用及与预后的关系。研究方法选取随访资料完整的60例乳腺癌病人为研究对象,用免疫组化方法检测60例乳腺癌原发肿瘤及癌旁组织中Kif2a和CEACAM1的表达。统计分析与生存率的关系。研究结果1.驱动蛋白Kif2a在乳腺癌组织中的表达高于相应癌旁组织中的表达免疫组织化学方法检测60例乳腺癌样本及相应的癌旁组织。结果显示,57%（34／60）病例中癌组织Kif2a表达高于癌旁组织,癌旁组织Kif2a表达明显低于癌组织,原发乳腺癌组织与癌旁组织中Kif2a表达有显著性差异（p<0.05）。2. CEACAM1在乳腺癌组织中的表达低于相应癌旁组织中的表达免疫组织化学检测60例乳腺癌样本及相应的癌旁组织。结果显示,65%（39／60）的原发癌组织CEACAM1表达低于癌旁组织,癌旁组织CEACAM1表达明显高于癌组织（P<O.05）。3.驱动蛋白Kif2a与癌胚抗原相关黏附分子CEACAM1在乳腺癌组织中表达的相关性驱动蛋白Kif2a在乳腺癌组织中的表达与CEACAM1在乳腺癌组织中表达进行对比研究,结果显示：P<0.05,R=-0.295,两者有相关性,癌组织中Kif2a和CEACAM1的表达水平两者呈负相关,Kif2a表达越高CEACAM1表达越低,反之亦然。4.癌胚抗原相关黏附分子CEACAM1在乳腺癌组织中表达与生存率有关本组60例病人从手术日起计算,5年生存率为85%（51／60）,10年生存率为65%（39／60）。在CEACAM1呈中、高表达的病例中,10年生存率80%,低表达或不表达病例中,10年生存44%。CEACAM1呈中、高表达组的生存率明显高于低表达或不表达组。CEACAM1表达与病人年龄、肿瘤大小、肿瘤病理分级和淋巴结转移无关（P>0.05）。结论1. Kif2a在乳腺癌组织中呈高表达,癌旁组织相对低表达；相反,癌组织中CEACAM1低表达,癌旁组织高表达。2. Kif2a和CEACAM1两者在癌组织中的表达呈负相关,乳腺癌组织中Kif2a表达越高，CEACAM1表达越低。相反,乳腺癌组织中Kif2a表达越低,CEACAM1表达越高。3.乳腺癌组织中Kif2a和CEACAM1表达都与预后相关,Kif2a表达上调、CEACAM1表达下调或不表达的病人预后差,联合检测Kif2a和CEACAM1可望成为预测乳腺癌预后的重要因子。1.本课题首次检测了乳腺癌原发肿瘤和癌旁组织中Kif2a的表达情况,通过临床病理资料分析、10年以上的随访,阐述了Kif2a的表达与病人转移和预后的相关性。2.本课题首次通过应用siRNA干扰技术、体外细胞功能实验,从细胞增殖、迁移、侵袭等方面全面、深入地探讨了Kif2a在乳腺癌的发生、发展及预后中的作用。3.本课题首次研究癌基因Kif2a和抑癌基因CEACAM1在同一乳腺癌组织中的表达及两者之间的表达关系,联合检测乳腺癌Kif2a和CEACAMl是判断预后的重要因子。4.本课题结果为Kif2a后续的、以Kif2a为靶点的靶向治疗和药物开发提供新思路。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一部分 驱动蛋白Kif2a在乳腺癌中表达的临床意义
• 前言
• 一.微管驱动蛋白Kif2a的来源、结构与功能
• 二.微管驱动蛋白Kif2a与肿瘤及侵袭转移的关系
• 三.研究微管驱动蛋白Kif2a的意义和目的
• 实验材料
• 一.病例资料
• 二.免疫组织化学（IHC）试剂
• 三.Real time-PCR主要试剂
• 四.主要仪器和设备
• 实验方法
• 一.组织收集与保存
• 1. 石蜡组织
• 2. 新鲜组织总RNA提取
• 二.新鲜组织实时定量逆转录多聚酶链反应（Real time RT-PCR）
• 1. Real time RT-PCR
• 2. 琼脂糖凝胶电泳
• 三.免疫组织化学染色
• 四.统计学处理方法
• 结果
• 一.驱动蛋白Kif2a在乳腺癌和癌旁组织中的表达情况
• 1. Kif2a在乳腺癌组织中的表达高于相应癌旁组织
• 2. Kif2a在乳腺癌和癌旁组织中mRNA水平的表达
• 二.Kif2a在乳腺癌组织中过表达与临床病理特点的相关性分析
• 三.Kif2a在乳腺癌组织中表达与病人预后的关系
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 转染Kif2a-siRNA对乳腺癌MCF-7细胞恶性行为的影响
• 前言
• 实验材料
• 一.细胞系
• 二.Kif2a-siRNA转染
• 三.RNA提取及RT-PCR试剂
• 四.Western Blot检测试剂
• 五.细胞功能实验试剂
• 六.四甲基偶氮唑蓝法（Methyl Thiazolyl Tetrazoliun,MTT）检测试剂
• 七.细胞凋亡检测
• 八.迁移和侵袭实验
• 九.主要仪器设备
• 实验方法
• 一.乳腺癌细胞株筛选
• 二.细胞总RNA提取
• 三.Western Blotting检测
• 四.Kif2a-siRNA转染
• 五.MTT增殖检测
• 六.细胞迁移能力的检测
• 七.细胞侵袭能力的检测
• 八.流式细胞术检测细胞凋亡
• 九.统计学处理方法
• 实验结果
• 一.沉默Kif2a基因对乳腺癌细胞MCF-7形态的影响
• 二.乳腺癌MCF-7细胞转染Kif2a-siRNA后Kif2a转录水平和蛋白水平的表达降低
• 三.沉默Kif2a基因抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖
• 四.沉默Kif2a基因抑制乳腺癌MCF-7细胞的迁移能力
• 五.沉默Kif2a基因抑制乳腺癌MCF-7细胞的侵袭能力
• 六.沉默Kif2a基因对乳腺癌MCF-7细胞凋亡率无明显影响
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三部分 驱动蛋白Kif2a与癌胚抗原黏附分子CEACAM1在乳腺癌组织中表达以及与预后的关系
• 前言
• 一.CEACAM1的结构
• 二.CEACAM1与肿瘤细胞生长
• 三.CEACAMl与肿瘤血管生成
• 实验材料
• 一.病例资料
• 二.免疫组织化学染色试剂
• 三.主要仪器和设备
• 实验方法
• 一.病人和组织标本收集
• 二.免疫组织化学染色（IHC）
• 三.统计学处理方法
• 实验结果
• 一.驱动蛋白Kif2a在乳腺癌组织中表达低于相应癌旁组织
• 二.CEACAM1在乳腺癌组织中表达低于相应癌旁组织
• 三.驱动蛋白Kif2a与CEACAM1在乳腺癌组织中表达的相关性
• 四.CEACAM1在乳腺癌组织的表达水平与生存率有关
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 论文不足之处
• 附图表
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表论文情况
• 学位论文评阅及答辩情况表
• 附件