猪CD163和Sn的分子克隆、原核表达与免疫血清制备

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）以妊娠母猪繁殖障碍和各年龄段猪呼吸道症状为主要特征,是对养猪业危害最为严重的一种病毒性传染病。PRRSV主要感染猪的巨噬细胞,引起严重的免疫抑制。病毒以受体介导的胞吞作用进入靶细胞,目前已知的受体分子有硫酸乙酰肝素、唾液酸粘附素（sialoadhesin, Sn）和CD163,其中硫酸乙酰肝素为非特异吸附分子,Sn介导病毒的特异性吸附和进入,CD163主要与病毒的细胞内脱衣壳有关。目前PRRS主要用疫苗接种预防,但随着病毒的不断变异,免疫效果不佳,因此迫切需要研究防控PRRS的新策略。本研究的目的是获得猪CD163和Sn重组抗原和免疫血清,为PRRSV受体分子的靶向RNA干涉和基因敲除等防控新策略研究提供检测试剂。根据发表的序列设计引物,先用RT-PCR从猪巨噬细胞RNA中扩增猪CD163和Sn cDNA片段,再用PCR扩增亲水性和抗原指数较高的cDNA片段,将其克隆入质粒载体进行序列测定。将序列正确的cDNA片段克隆入含细胞毒性T细胞相关抗原4（CTLA-4）胞外区（IgV）编码序列的原核表达载体,用IPTG诱导重组菌表达,用镍亲和柱纯化融合蛋白。以50μg蛋白/只的剂量3次免疫小鼠,用间接ELISA检测抗体效价。以表达CD163和Sn的猪巨噬细胞和不表达CD163和Sn的PK15细胞为抗原,用Western blotting和间接免疫荧光验证免疫血清的特异性。结果显示RT-PCR扩增产物的大小与预期结果相符,CD163与发表序列的核苷酸序列同源性为99.5%,Sn与发表序列的核苷酸序列同源性为99.4%,氨基酸序列同源性均为100%；重组大肠杆菌表达的CTLA-4IgV-CD163和CTLA-4IgV-Sn融合蛋白为预期的43kDa和32Da,主要以包涵体形式存在。免疫小鼠血清的ELISA抗体效价分别为1：300000和1：40000,能在CD163+和Sn+细胞中检测到预期的120kDa和210kDa蛋白条带,而在对照细胞中未检测到相应的蛋白条带。间接免疫荧光试验结果显示,免疫血清与CD163、 Sn转基因3T3细胞呈阳性反应。这些研究结果表明,获得的猪CD163和Sn重组抗原和免疫血清可用于PRRSV感染和RNA干扰等试验的检测。

论文目录

摘要

Abstract

符号说明

综述一：猪繁殖与呼吸障碍综合征研究进展

摘要

1.PRRS病原学

2.流行病学

3.致病机制

4.遗传与变异

5.诊断学研究

6.综合防制

7.参考文献

综述二：猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒细胞受体研究进展

摘要

1.病毒受体

2.猪繁殖与呼吸综合征病毒

3.猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理

4.猪繁殖与呼吸综合征病毒的细胞受体

5.结语

6.参考文献

研究内容一：猪CD163的分子克隆、原核表达与免疫血清制备

摘要

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

研究内容二：猪Sn的分子克隆、原核表达与免疫血清制备

摘要