应用基因组改组选育

论文摘要

对本实验室自主筛选的琥珀酸产生菌Actinobacillus succinogenes CGMCC 1593进行了钠离子耐受性研究,将菌株分别进行X-射线诱变、紫外线诱变和EMS化学诱变,筛选得到3株发酵性能有改良的菌株（X-8、UV-17及SE-6）,将其与实验室保存的经NTG诱变的高产菌株（SF-9）进行基因组改组方法选育高产耐钠菌株,获得4株稳定性较好的耐高浓度钠离子高产突变株,并对其中一株（F3-10）进行了初步发酵性能研究。通过菌种特性研究,确定采用菌龄5 h的菌体进行诱变处理,并确定了筛选平板中NaCl临界浓度为0.8 mol/L;通过致死曲线的测定,确定了X-射线诱变照射时间40 min,紫外诱变照射时间20 s,EMS诱变处理浓度为2.0%,处理时间为20 min。出发菌株分别经X-射线诱变、紫外线诱变和EMS诱变,采用高浓度钠离子平板进行初筛,然后进行厌氧瓶发酵HPLC复筛获得3株钠离子耐受性较好、琥珀酸产量较高的菌株X-8、UV-17及SE-6。对菌种原生质体制备及再生的影响因素进行了考察,确定采用菌龄为5 h的菌体,酶解时溶菌酶浓度为0.1 mg/mL,37℃酶解30 min,渗透压稳定剂为0.3 mol/L的蔗糖,再生培养方式采用双层平板再生。对原生质体灭活标记条件进行了研究,确定紫外灭活5 min,55℃热灭活25 min后原生质体灭活率达100%。对原生质体融合条件进行了研究,确定融合条件为采用浓度为40%的PEG6000为助融剂,融合温度为37℃,融合时间2 min,此时融合率达2.78×10-5。采用多母本原生质体递近融合技术,经过三轮改组后筛选得到4株稳定性较好的高产突变株F3-2、F3-10、F3-13、F3-15,其中一株F3-10在厌氧瓶发酵培养基中发酵48 h,琥珀酸积累39.7 g/L,较原始菌株SW0580提高了36.0%,而在含0.2 mol/LNaCl培养基中发酵时琥珀酸产量为30.3 g/L,较原始菌株SW0580的17.6 g/L提高了72.1%;以甘蔗糖蜜为原料在5 L发酵罐中采用Na2CO3控制发酵pH厌氧发酵48 h,琥珀酸积累40.6 g/L,较出发菌SW0580（26.8 g/L）提高56.2%。F3-10菌株的耐钠和发酵产酸性能较原菌株有明显改善。初步考察了突变株的发酵性能,在5 L发酵罐中分别以甘蔗糖蜜、麦芽糖糖浆及葡萄糖为碳源进行琥珀酸发酵,发现利用甘蔗糖蜜作碳源时发酵产琥珀酸效果最好;分别考察了酵母膏、玉米浆浓度对发酵罐中发酵产琥珀酸的影响,发现培养基中不添加酵母膏时,琥珀酸产量明显降低,增大培养基中玉米浆浓度时,琥珀酸产量相应提高。以麦芽糖浆为原料在25 L发酵罐中对琥珀酸发酵进行了放大试验,发酵48 h,琥珀酸积累33.2 g/L,基本能维持5 L发酵罐中以麦芽糖浆为原料时的产酸水平。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 琥珀酸概述
• 1.1.1 琥珀酸的理化性质
• 1.1.2 琥珀酸用途和市场概况
• 1.1.3 国内外琥珀酸生产技术现状
• 1.2 菌种选育技术
• 1.2.1 自然选育
• 1.2.2 诱变育种
• 1.2.3 杂交育种
• 1.2.4 代谢控制育种
• 1.2.5 基因工程育种
• 1.3 基因组改组技术
• 1.3.1 基因组改组的原理
• 1.3.2 基因组改组与传统育种技术相比的优点
• 1.3.3 应用基因组改组进行菌种性能改进的实例
• 1.4 本论文的研究意义
• 1.5 本课题的主要研究内容
• 第二章 琥珀酸放线杆菌耐高浓度钠离子菌株的诱变育种
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 主要试剂
• 2.2.2 仪器设备
• 2.2.3 出发菌株（亲株）
• 2.2.4 培养基与培养方法
• 2.2.5 方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 种子生长曲线的测定
• 2.3.2 氯化钠浓度对亲株SW0580 发酵生产琥珀酸的影响
• 2.3.3 筛选平板的确定
• 2.3.4 X-射线诱变
• 2.3.5 紫外线诱变
• 2.3.6 EMS 诱变
• 2.4 本章小结
• 第三章 基因组改组方法选育高产耐钠菌株
• 3.1 前言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 仪器设备
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 菌种
• 3.2.4 培养基与溶液配制
• 3.2.5 方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 原生质体制备与再生条件研究
• 3.3.2 原生质体灭活标记条件研究
• 3.3.3 原生质体融合条件研究
• 3.3.4 基因组改组与融合子的筛选
• 3.3.5 各轮改组中获得的突变株发酵试验
• 3.3.6 突变株F3-10 稳定性试验
• 3.3.7 突变株F3-10 在5 L 发酵罐中发酵试验
• 3.4 本章小结
• 第四章 突变株发酵性能的初步研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 主要试剂与原料
• 4.2.2 仪器与设备
• 4.2.3 菌种
• 4.2.4 培养基
• 4.2.5 方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 5 L 发酵罐中不同碳源分批发酵生产琥珀酸
• 4.3.2 发酵罐培养基中不添加酵母膏发酵生产琥珀酸
• 4.3.3 发酵罐中玉米浆浓度对发酵产琥珀酸的影响
• 4.3.4 25 L 发酵罐中放大试验
• 4.4 本章小结
• 总结与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文