增强型绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞移植治疗帕金森病大鼠

论文摘要

帕金森病（Parkinson’s Disease，PD）是一种由于黑质和蓝斑含色素多巴胺能神经元进行性变性缺失所致的神经系统变性疾病。临床上以进行性加重的静止性震颤、运动迟缓、肌强直为主要特征。随着人类寿命的延长，其发病率已明显上升。目前虽然有美多巴和其他抗PD药物，但上述药物仅能改善症状，非病因治疗，不能延缓疾病的进展，而且长期应用后会出现相关副作用和疗效减退，因此目前探索PD的病因治疗显得尤为重要。由于致PD运动症状的神经元变性缺失范围主要位于中脑黑质，因此用干细胞移植行替代治疗极有可能改变上述状况。目前供选择的移植种子细胞包括：胚胎黑质细胞、胚胎干细胞、神经干细胞及骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）等。MSCs因具有较强的自我更新能力、多向分化潜能、取材方便、移植不存在伦理学障碍、有望在临床实现自体移植等优点而备受关注。为此我们将探索MSCs体外稳定的培养扩增实验方法，并了解其体外分化为神经细胞的能力，然后将标记好的干细胞移植入PD大鼠脑内，观察效果并用相关实验方法分析其可能的作用机制。第一部分大鼠骨髓间充质干细胞体外培养、鉴定及向多巴胺能神经元的分化目的：研究大鼠MSCs体外培养和增殖能力及纹状体提取液诱导其分化为多巴胺能神经元（dopaminergic neuron，DN）的潜能。方法：取4-6周雄性SD大鼠完整的股骨、胫骨，用预冷的MSCs培养基反复冲洗骨髓腔，待双侧股骨、胫骨骨髓腔全部冲洗干净后，用1ml注射器反复抽吸骨髓悬浮液，以打散细胞团制成单细胞悬液，再接种于六孔板培养。待细胞长至80—90％融合时即可进行传代。采用流式细胞仪对其进行鉴定，后再分为A、B、C3组，前5天每组均用预诱导液诱导，后10天A组换用1：1体积比稀释的纹状体提取液，B组换用1：2体积比稀释的纹状体提取液，C组则继续用预诱导液诱导，在诱导后的第5和15天分别行巢蛋白（Nestin）、胶质细胞源性蛋白（GFAP）、神经元特异性烯醇酶（NSE）和酪氨酸羟化酶（TH）免疫细胞化学鉴定，并对DN阳性细胞行计数，确定各组DN阳性率。结果：MSCs贴壁生长，排列成束状，漩涡状或放射状，梭形细胞胞浆较丰富，核大，呈卵圆形，核仁明显，可以维持体外长期培养增殖，传至15代，细胞形态和生长速度均无变化。流式细胞仪检测第6代骨髓间充质干细胞，其CD44、CD45、CD90、CD105阳性表达率分别为98．37％、0．56％、95．55％、84．45％。经过诱导后细胞呈多极或双极，并表达Nestin、GFAP、NSE及TH。A、B、C 3组在第15天诱导出的DN阳性率分别是（11．9±0．5）％、（8．3±0．3）％及（1．6±0．2）％，经x2检验A组和C组有统计学差异。结论：MSCs可以在体外成功分离培养、扩增、纯化，具有向神经细胞分化的潜能，使用纹状体提取液能诱导其向DN分化，其有望成为移植治疗帕金森病的工具细胞。第二部分2型重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白在大鼠骨髓间充质干细胞的表达目的：研究携带增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）的2型重组腺相关病毒（rAAV2-EGFP）转染MSCs的效率、表达时间及对细胞增殖的影响。方法：体外培养出MSCs，经鉴定后将P4代细胞分为rAAV2组和PBS组，先用0．25％胰酶将MSCs打散，然后rAAV2组中按感染复数106加入0．1ml rAAV2-EGFP：PBS组中加入0．1ml PBS作对照，培养1小时后再向每孔中加入1ml全培养基继续培养。细胞铺满瓶底后进行传代，均传代5次。最后用流式细胞仪对两组的P5和P10代细胞EGFP转染率进行检测。另分别取两组P10 MSCs制成单细胞悬液，用新鲜的培养基重悬细胞调浓度稀释至5×103cells／ml，接种于24孔板中，每孔1ml，接种24孔，于培养箱中培养。每天计数3个孔的细胞，连续计数8天，据此绘制两组细胞生长曲线。结果：rAAV2组P5和P10代MSCs转染率分别为（21．71±1．02）％、（20．34±1．13）％；PBS组的转染率分别为（0．89±0．05）％、（0．96±0．07）％。经检验，两组相对应代数细胞的转染率具有显著性差异，rAAV2组内两代细胞的转染率无显著性差异。生长曲线显示rAAV2组细胞较PBS组生长缓慢。结论：rAAV2-EGFP转染MSCs效率高，持续表达时间长，且对细胞扩增传代无影响，标记后的细胞可用于观察干细胞在体内的存活、迁徙及分化。第三部分增强型绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞移植治疗帕金森病大鼠目的：探讨MSCs移植入PD大鼠的疗效及其在脑内存活、迁徙、分化规律，并初步探讨其改善症状的可能机制。方法：将造模成功的PD大鼠随机分为两组，将EGFP标记的MSCs和PBS分别移植入两组PD模型纹状体内。术后每周进行旋转试验，第1周和第9周行脑神经元特异性核蛋白（Neun）、GFAP、TH的免疫组化鉴定，第9周行Western blot检测两组模型纹状体内TH和脑源性神经营养因子（BDNF）的表达。结果：移植前两组平均每分钟旋转次数分别为（8．24±0．56）圈、（8．27±0．61）圈，无统计学意义（P＞0．05）；术后第3周分别为（7．46±0．53）圈、（8．13±0．61）圈，差异有显著性（P＜0．05），并持续至术后第9周。移植后第1周MSCs主要分布于针道附近，第9周则迁徙至两侧大脑半球，以移植侧半球为主，最远迁徙至胼胝体的末端。小脑及脑干未见移植细胞。全脑未见畸胎瘤的形成。术后第1周免疫组化染色仅见GFAP和Neun表达，第9周GFAP、Neun仍有表达，以GFAP居多，同时在纹状体内还可见少量TH表达，提示MSCs在脑内主要分化为胶质细胞，部分为神经元，少数分化为DN。PBS组免疫组化染色未见上述蛋白的表达。Western blot检测仅MSCs组大鼠纹状体有TH的表达，MSCs组大鼠纹状体BDNF表达水平较PBS组有显著性差异。结论：MSCs移植入纹状体后可能通过多重机制来改善PD症状，其移植治疗PD大鼠模型可能是安全有效的。

论文目录

• 缩略语简表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 大鼠骨髓间充质干细胞体外培养、鉴定及向多巴胺能神经元的分化
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 2型重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白在大鼠骨髓间充质干细胞的表达
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 增强型绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞移植治疗帕金森病大鼠
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 结论
• 综述
• 帕金森病的细胞移植治疗研究
• 帕金森病非运动症状及处理
• 发表论文
• 致谢