OsWRKY10基因的水稻突变体互补转化及在烟草中的初步功能分析

论文摘要

WRKY是广泛存在于植物中的一类转录因子,参与植物对病原物的防卫反应、非生物胁迫反应以及某些生长发育的生理过程,是最近研究的热点。OsWRKY10是本实验室确定的一个新的WRKY类转录因子基因。它是利用水稻T-DNA插入突变体库筛选出的一个发育迟缓突变体（定名为T456）,分析结果表明其性状很可能是由T-DNA插入引起,采用Tail-PCR的方法得到侧翼序列,再结合基因预测设计引物,从水稻cDNA文库中分离到了该基因。 本实验将含约2 kb启动子序列的OsWRKY10基因（G3）构建到Cambial301中,获植物表达载体（pCam-G3）。将pCam-G3和用于卡那霉素筛选的植物表达载体pCHF3,用基因枪法转化T456,最后得到了3个株系;经过PCR检测,呈阳性。T0代有两种表型,其中有1株与T456的表型无明显差异,但另2株与T456的母本水稻中花11的表型更接近。T456自交后代的表型分离提示T456的表型可能受一对隐性核基因控制,因此该实验结果暗示了T456的表型可能是由OsWRKY10基因的表达变异所致。 为了更好的研究OsWRKY10基因的功能,在烟草中超表达了该基因。构建了OsWRKY10与绿色荧光蛋白GFP基因融合的载体pCamU-OsWRKY10-GFP和超表达载体pCamU-OsWRKY10,并用优化的农杆菌介导法转化三生烟,分别得到16个和14个PCR阳性的转基因植株。荧光显微镜观察表明OsWRKY10-GFP融合蛋白主要位于细胞核,说明OsWRKY10能在细胞核内起作用。另外,对部分转超表达载体的T0代烟草叶片进行了黑胫病菌（Phytophthora parasitica var nicotianae）接种,初步结果显示了转OsWRKY10基因的烟草增强了抗病性。

论文目录

• 第一章 文献综述
• 1.1 植物转录因子
• 1.1.1 植物转录因子的结构和分类
• 1.1.2 植物转录因子的功能
• 1.1.3 研究高等植物转录因子的方法
• 1.1.4 小结
• 1.2 WRKY类转录因子
• 1.2.1 WRKY类转录因子的概述
• 1.2.2 WRKY基因的基本结构与分类
• 1.2.3 WRKY蛋白与W盒的结合
• 1.2.4 WRKY转录因子的起源
• 1.2.5 WRKY转录因子的生物学功能
• 1.2.6 确定WRKY因子在有机体内的靶基因
• 1.2.7 小结
• 1.3 背景及意义
• 第二章 OsWRKY10转化延迟发育水稻突变体T456
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 OsWRKY10基因的植物表达载体pCam-G3
• 2.1.3 pCam-G3和pCHF3载体的酶切鉴定
• 2.1.4 水稻愈伤的培养
• 2.1.5 基因枪介导的水稻转化
• 2.1.6 转基因水稻植株的获得
• 2.1.7 转基因植株的PCR鉴定
• 0代的表型'>2.1.8 转基因水稻T₀代的表型
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 pCam-G3和pCHF3的酶切鉴定结果
• 2.2.2 水稻胚性愈伤的培养
• 2.2.3 转基因植株的获得
• 0代转基因植株PCR鉴定'>2.2.4 T₀代转基因植株PCR鉴定
• 0代的表型'>2.2.5 转基因水稻T₀代的表型
• 2.3 讨论
• 2.3.1 基因枪法介导转化水稻
• 2.3.2 转基因植株的获得
• 2.4 附图
• 0代抗病性分析'>第三章 OsWRKY10的烟草转化、亚细胞定位观察及T₀代抗病性分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 转化载体的构建
• 3.1.3 载体质粒的酶切鉴定
• 3.1.4 载体质粒转入农杆菌感受态细胞
• 3.1.5 重组转化子的鉴定
• 3.1.6 烟草叶片的侵感染与潮毒素抗性植株的再生
• 0代转基因烟草的PCR鉴定'>3.1.7 T₀代转基因烟草的PCR鉴定
• 3.1.8 OsWRKY10与GFP融合蛋白的亚细胞定位观察
• 0代抗病性的初步测定'>3.1.9 转基因烟草T₀代抗病性的初步测定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 转化载体的结构
• 3.2.2 载体质粒的酶切鉴定
• 3.2.3 双元表达载体的农杆菌转化检测
• 3.2.4 烟草基因转化及潮毒素抗性植株的获得
• 3.2.5 转基因烟草的PCR检测
• 3.2.6 OsWRKY10与GFP融合蛋白的亚细胞定位观察
• 0代转基因烟草增强对黑胫病菌的抗性'>3.2.7 T₀代转基因烟草增强对黑胫病菌的抗性
• 3.3 讨论
• 3.3.1 关于转化载体
• 3.3.2 农杆菌介导法获得转基因烟草
• 3.3.3 OsWRKY10与GFP融合蛋白的亚细胞定位观察
• 0代转基因烟草增强对烟草黑胫病菌的抗性'>3.3.4 T₀代转基因烟草增强对烟草黑胫病菌的抗性
• 3.4 附图
• 参考文献
• 附录