基于分子标记的山核桃生殖特性研究

论文摘要

山核桃为浙江省重要的经济树种,其种下无品种。近年来细胞生物学的研究发现,山核桃中存在无融合生殖;分子标记对基因组DNA的研究发现,山核桃天然群体的多态性不佳。为此,本研究根据无融合生殖植物的特性,在建立天然群体山核桃及其半同胞子代组成的亲子代研究群体的基础上,对山核桃的生殖进行了研究。研究结果如下:1、建立了由40个来自天然群体山核桃单株及每个亲本10个自由授粉子代共计440个单株组成的研究群体;在苗木培育的过程中发现占全部发芽种子4.04%的双胚苗。2、建立了适合山核桃的SRAP分析体系,并比较了RAPD、ISSR、SRAP三种分子标记在山核桃中的扩增,认为在山核桃研究中可以考虑使用SRAP并结合RAPD标记。就天然群体随机交配的情况,分别考虑异交、无融合生殖、自交显性分子标记。3、建立了分子标记数据结构,构建了似然函数,用EM(期望最大化)算法来估计未知参数(等位基因概率p、异交比例ω、无融合生殖比例θ),检测异交和无融合生殖的显著性,并分别针对200及400个个体的天然群体,用计算机模拟来检测统计模型估计未知参数的精度。结果表明,发展的统计模型可以很好的估计参数,且随样本量的增加,参数的估计更为完美。4、使用RAPD及SRAP分子标记技术对研究群体进行分析,两种分子标记共扩增出199个位点,其中多态性位点168个,占84.42%。使用发展的统计模型对实验的真实数据进行分析,发现模型可以估计等位基因概率p、异交比例ω、无融合生殖比例θ,且发现山核桃无融合生殖比例为32%左右,从DNA水平说明山核桃中存在无融合生殖现象。5、使用24对RAPD及15对SRAP引物对4个山核桃母本及其9粒种子的双胚苗进行分析,结果发现RAPD没有扩增出多态性,仅SRAP引物对F6/R8扩增出一条仅在双胚苗中出现的400bp片段;对其进行克隆测序,发现该片段与衰老相关蛋白有关,且并非山核桃多胚苗所特有,不能说明它和无融合之间的关系。认为山核桃中的无融合生殖为非完全无融合生殖。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 山核桃研究概况
• 1.1 山核桃简介
• 1.2 山核桃研究进展
• 1.2.1 栽培研究
• 1.2.2 基因克隆
• 1.2.2.1 DDRT-PCR 及cDNA-AFLP 技术
• 1.2.2.2 同源克隆-RACE 方法以及染色体步移
• 1.2.2.3 454 测序
• 1.2.2.4 cDNA 文库
• 1.2.3 细胞学研究
• 1.2.3.1 山核桃雄蕊发育的解剖生物学研究
• 1.2.3.2 山核桃雌花发育的解剖学研究
• 1.2.4 遗传研究
• 1.2.4.1 山核桃群体结构及遗传多样性
• 1.2.4.2 山核桃杂交实验研究
• 1.2.5 其它相关研究
• 2 分子标记
• 2.1 基于分子杂交技术的分子标记技术
• 2.1.1 RFLP
• 2.1.2 VNTR
• 2.2 基于PCR 技术的分子标记技术
• 2.2.1 非特异引物的PCR 扩增
• 2.2.1.1 RAPD
• 2.2.1.2 ISSR
• 2.2.1.3 SRAP
• 2.2.2 特异引物的PCR 扩增
• 2.2.2.1 SSR
• 2.2.2.2 SCAR
• 2.2.2.3 SSCP
• 2.2.2.4 STS
• 2.3 基于限制性酶切和 PCR 技术的DNA 标记
• 2.3.1 AFLP
• 2.3.2 CAPs
• 2.4 基于DNA 芯片技术的分子标记技术
• 2.5 几种常用分子标记技术的比较
• 3 无融合生殖
• 3.1 无融合生殖的概念
• 3.2 无融合生殖研究的意义
• 3.3 无融合生殖在植物中的分布
• 3.4 无融合生殖的机理
• 3.5 无融合生殖与多胚苗的关系
• 4 研究目的意义及技术路线
• 4.1 研究目的意义
• 4.2 技术路线
• 第二章 材料与方法
• 1 材料
• 2 试剂
• 3 仪器设备
• 4 方法
• 4.1 山核桃基因组 DNA 的提取
• 4.2 SRAP 分析
• 4.2.1 SRAP 分析体系的建立
• 4.2.2 SRAP-PCR 扩增条件的优化
• 4.2.3 SRAP 引物筛选
• 4.3 ISSR 分析
• 4.4 RAPD 分析
• 4.5 SPAR、RAPD、ISSR 三种分子标记的比较
• 4.6 山核桃亲子代的分子标记分析
• 4.6.1 山核桃亲子代的 SRAP 分析
• 4.6.2 山核桃亲子代的 RAPD 分析
• 4.7 分子标记分析结果的统计模型
• 4.7.1 统计参数的估计
• 4.7.2 统计模型的建立及其计算机模拟
• 4.7.3 实验真实数据的统计分析
• 4.8 山核桃双胚苗的分析
• 4.8.1 材料
• 4.8.2 分子标记分析
• 4.8.3 割胶回收多态性片段
• 4.8.4 DNA 回收片断与载体连接
• 4.8.5 连接产物的转化与克隆测序
• 4.8.6 特异引物设计及 PCR 扩增
• 第三章 结果与分析
• 1 山核桃半同胞子代苗的培育
• 2 山核桃基因组DNA 的提取
• 3 SRAP 体系优化及与RAPD、ISSR 比较
• 3.1 SRAP 体系的建立
• 3.1.1 镁离子浓度
• 3.1.2 引物浓度
• 3.1.3 dNTPs 浓度
• 3.1.4 Taq 酶浓度
• 3.1.5 模板浓度
• 3.1.6 SRAP-PCR 反应条件的优化
• 3.1.7 SRAP 引物筛选
• 3.2 SRAP、RAPD、ISSR 三种分子标记的比较
• 3.2.1 山核桃 RAPD 分析
• 3.2.2 山核桃 ISSR 分析
• 3.2.3 山核桃 SRAP 分析
• 4 分子标记分析数据的统计分析
• 4.1 数据结构及似然函数
• 4.1.1 共显性标记数据结构及似然函数
• 4.1.2 显性标记数据结构及似然函数
• 4.2 未知参数的估计
• 4.3 异交和无融合生殖发生的显著性检验
• 4.4 模型的计算机模拟
• 5 山核桃亲子代的分子标记分析
• 5.1 山核桃亲子代的SRAP 分析
• 5.2 山核桃亲子代的RAPD 分析
• 5.3 天然群体及半同胞子代分子标记分析数据的统计分析
• 6 山核桃双胚苗的分子标记分析
• 6.1 山核桃双胚苗的SRAP、RAPD 标记分析
• 6.2 多态性片断克隆测序与亲子代基因组 DNA 的PCR 扩增
• 6.3 特异引物设计及PCR 扩增
• 7 结论
• 8 讨论
• 参考文献
• 个人简介
• 攻读硕士学位期间完成的论文
• 致谢