重组大肠杆菌高效分泌表达杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶

论文摘要

β-葡聚糖酶是重要的工业用酶,可有效消除谷物β-葡聚糖在酿造和饲料工业中产生的负面影响。国内对β-1,3-1,4-葡聚糖酶的研究还处于初级阶段,天然菌株的产酶量及酶的性能满足不了实际应用。然而,分子生物学、基因工程方法的应用为其提供了契机。现在对β-1,3-1,4-葡聚糖酶的研究主要集中在构建基因工程菌株来提高酶的产量和性能方面。本研究应用工业生物技术进行了一系列的探索,旨在找到一种可持续发展的,可用于产业化、规模化的生产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的方法。主要研究内容包括:1.发酵罐流加培养重组大肠杆菌JMl09-pLF3生产β-1,3-1,4-葡聚糖酶在原有优化培养基基础上,优化了发酵工艺,在7 L发酵罐上进行了分批补料发酵产酶研究。结果表明,在12～32 h之间向发酵罐内恒速流加双倍浓缩的培养基氮源,对细胞生长和产酶有极大的促进作用。最大酶活增长到1680 U/mL,比间歇发酵提高了231.40%;最大细胞密度为7.67 g/L,是间歇发酵3.44倍。2.高效分泌表达β-1,3-1,4-葡聚糖酶重组大肠杆菌的构建将热稳定性较好的杂合β-1,3-1,4-葡聚糖酶表达基因（bgl）插入质粒pET-22b（+）,并插入kil-Km分泌盒,得到了新的β-葡聚糖酶表达质粒pET-22-bgl-（kil-Km）。将重组质粒转化大肠杆菌E coli JM109和BL21（DE3）。通过SDS-PAGE证明了含有质粒pET-22-bgl-（kil-Km）的重组菌株具有目的蛋白的高效分泌表达的功能。3.响应面法优化重组E.coli BL21（DE3）-pET-22-bgl-（kil-Km）产酶培养基在TB培养基基础上,通过单因素实验选择乳糖为最佳碳源,酪蛋白胨为最佳氮源。在单因素优化基础上采用Box-Behnken设计法和RSM响应面分析法考察主要影响因素乳糖浓度、酪蛋白胨浓度和碳氮比三因素的的交互作用。确定了重组E.coli BL21（DE3）-pET-22-bgl-（kil-Km）产酶的优化培养基配方为（g/L）:酪蛋白胨33.39,乳糖8.03,甘油9.15,NaCl 10.0,KH2PO42.31,K2HPO4 12.54。利用优化培养基在37℃、150 rpm条件下,摇瓶培养32.5 h,酶活达到1242.94 U/mL,比初始培养基提高了3.3倍。4.重组酶的分离纯化和酶学性质表征利用Ni2+与6×His标签特异性结合的性质利用亲和层析纯化重组酶,该方法将目的蛋白纯化了7.69倍,纯化后重组酶的活力为1706.2 U/mL,比活11261.6U/mg,酶活回收率达到86.44%。通过SDS-PAGE分析,可知带有6个His标签的β-葡聚糖酶分子量为26 kDa左右。重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶学性质为:最适反应温度和耐热温度均为50℃,最适反应pH在6.0～7.0之间,碱性条件下稳定性较高。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 引言
• 1.1 β-葡聚糖概述
• 1.2 β-1,3-1,4-葡聚糖酶
• 1.2.1 β-葡聚糖酶的分类
• 1.2.2 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的来源
• 1.2.3 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的结构和作用机理
• 1.2.4 不同微生物来源的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶学性质
• 1.2.5 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的应用现状
• 1.3 β-葡聚糖酶的生产
• 1.3.1 提取分离法
• 1.3.2 生物合成法
• 1.4 β-葡聚糖酶的基因克隆和表达研究
• 1.4.1 β-1,3-1,4-葡聚糖酶分子生物学研究
• 1.4.2 杂合酶和热稳定性
• 1.4.3 原核表达系统
• 1.4.4 大肠杆菌表达产物的外分泌
• 1.4.5 pET系列原核表达系统
• 1.5 β-葡聚糖酶的分离纯化
• 1.5.1 蛋白质分离纯化技术
• 1.5.2 亲和层析技术
• 1.6 存在的问题
• 1.7 研究内容及选题意义
• 第二章 生产β-葡聚糖酶的重组大肠杆菌JM109（pLF3）流加发酵研究
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株及质粒
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 培养基及溶液的配制
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 种子培养
• 2.2.2 摇瓶水平培养条件优化
• 2.2.3 发酵罐间歇发酵
• 2.2.4 发酵罐流加培养
• 2.2.5 细胞干重的测定
• 2.2.6 发酵液OD值测定
• 2.2.7 OD值与细胞干重的校正
• 2.2.8 胞外酶活测定
• 2.2.9 高碘酸氧化法测定的甘油浓度（陈耀祖,1984）
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 摇瓶培养条件的优化
• 2.3.2 发酵罐间歇发酵
• 2.3.3 发酵罐流加发酵培养
• 2.4 小结
• 第三章 β-1,3-1,4-葡聚糖酶分泌表达载体pET22-bgl-（kil-Km）的构建以及在E.coil JM109中的表达
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株与质粒
• 3.1.2 工具酶
• 3.1.3 试剂
• 3.1.4 培养基及溶液的配制
• 3.1.5 主要仪器设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 重组载体pET-22-bgl的构建
• 3.2.2 重组载体pET22-bgl-（kil-Km）的构建
• 3.2.3 将重组质粒pET-22-bgl-（kil-Km）导入大肠杆菌BL21（DE3）
• 3.2.4 含有重组质粒pET-22-bgl-（kil-Km）的大肠杆菌分泌表达β-1,3-1,4-葡聚糖酶
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 重组质粒pET-22-bgl的构建
• 3.3.2 kil-Km分泌盒的插入
• 3.3.3 重组质粒pET-22-bgl-（kil-Km）构建过程图谱
• 3.3.4 含有重组质粒pET-22-bgl-（kil-Km）的大肠杆菌分泌表达β-1,3-1,4-葡聚糖酶
• 3.4 小结
• 第四章 重组大肠杆菌产酶培养基的优化
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌株与质粒
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 培养基及溶液的配制
• 4.1.4 主要仪器设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 培养条件
• 4.2.2 基础培养基的选择
• 4.2.3 最佳碳源、氮源的选择
• 4.2.4 碳源、氮源浓度的确定
• 4.2.5 适宜碳氮比的确定
• 4.2.6 响应面实验
• 4.2.7 胞内粗酶液和胞外粗酶液的制备
• 4.2.8 酶活测定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 两重组菌株在不同培养基中生长和产酶的比较
• 4.3.2 不同碳源对细胞生长和产酶的影响
• 4.3.3 不同氮源对细胞生长和产酶的影响
• 4.3.4 乳糖浓度对细胞生长和产酶的影响
• 4.3.5 酪蛋白胨浓度对细胞生长和产酶的影响
• 4.3.6 碳氮比对细胞生长和产酶的影响
• 4.3.7 响应面方法优化培养基
• 4.3.8 重组E.coli BL21（DE3）-pET-22-bgl-（kil-Km）在优化培养基中的培养
• 4.4 小结
• 第五章 带有组氨酸标签的杂合β-葡聚糖酶的分离纯化和酶学性质表征
• 5.1 材料
• 5.1.1 菌株与质粒
• 5.1.2 试剂
• 5.1.3 培养基及溶液的配制
• 5.1.4 主要仪器设备
• 5.2 实验方法和培养条件
• 5.2.1 培养条件
• 5.2.2 粗酶液的获得
• 5.2.2 酶的分离纯化
• 5.2.3 重组酶的酶学性质
• 5.2.4 考马斯亮蓝法检测蛋白浓度
• 5.2.5 胞外酶活测定
• 5.2.6 SDS-PAGE电泳
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 重组酶的亲和层析纯化
• 5.3.2 重组酶的酶学性质
• 5.4 小结
• 第六章 结论和展望
• 6.1 本研究主要结果
• 6.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢