T细胞疫苗对BXSB鼠免疫系统影响的实验研究

论文摘要

研究背景系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种常见的自身免疫性疾病，累及全身多系统和器官，发病机制复杂，临床变化多端，继发感染发生率高，诊治困难，是一种严重危害人类健康的疾病。其广泛分布于世界各地，全世界的患病率大约是70／10万-100／10万。如果以全国13亿人口计算，我国的SLE患者已达112-160万之多，且多见于年轻女性。SLE的发病与多种因素有关，一般认为是遗传素质、性激素、感染、药物和环境等相互间错综复杂的作用引起免疫调节功能紊乱，导致SLE的发生、持续和不易缓解。由于病因尚未明确，为其根治带来困难。近20年来，随着现代医学的迅速发展，早期诊断的手段增多和治疗水平的提高，SLE的10年生存率已达92％，预后明显改善。然而糖皮质激素结合免疫抑制剂药物仍然是目前治疗SLE的首选药物。一般病例采用大剂量糖皮质激素治疗后小剂量维持，对急性暴发性危重SLE患者用激素冲击疗法，效果不理想时联合使用细胞毒药物（主要是环磷酰胺和硫唑嘌呤）。采用这种常规治疗方法可使大部分患者病情稳定，但用药量大、时间长，药物的副作用不容忽视，如诱发或加重感染、糖尿病、消化道溃疡、穿孔或消化道出血，长期应用可引起高血压和动脉粥样硬化、骨折及骨缺血性坏死、精神异常、柯兴综合征、痤疮、多毛等。60％以上患者最后死于激素的副作用和／或并发症。严重影响患者的生存期和生活质量。因此寻求SLE新的治疗方法一直是国内外研究的热点。大剂量免疫球蛋白冲击疗法、血浆置换疗法等，虽能使病情得到暂时缓解，同样由于未能针对病因治疗，且花费高，不能广泛应用。新型免疫抑制剂包括B细胞治疗、抗CD20抗单克隆抗体治疗、T细胞治疗、抗细胞因子治疗、补体治疗等大部分处于动物实验阶段，其确切治疗效果尚须大量临床对照试验证实。近年来造血干细胞移植治疗取得了令人鼓舞的疗效，但存在高风险和技术条件要求高，部分患者在动员阶段不能耐受，价格昂贵，较难推广。由于SLE是以T和B淋巴细胞功能异常为主要特点的自身免疫性疾病，自身反应性T淋巴细胞的活化及由此介导的自身免疫反应是本病发生的中心环节。研究发现SLE发病过程中自身抗原应答性辅助性T细胞（help T cell,Th）增加。从狼疮鼠克隆的T细胞系能向B细胞提供协助，使之产生IgG型抗DNA抗体。50％的这些T细胞克隆中能识别核小体中的T细胞抗原表位。在人及鼠SLE的Th细胞克隆中，识别核小体抗原表位的TCRα链能结合不同TCRβ链，形成TCRαβ二肽链，识别多种T细胞抗原表位，协助多种B细胞克隆，产生多种自身抗体。在SLE迁延过程中，T细胞反复受自身抗原激活而增值，从而使突变率增加，其突变的T细胞能促使自身应答B细胞产生抗DNA抗体。这些抗体与相应自身抗原结合，形成免疫复合物，沉积于肾小球基底膜、肝脏、中枢神经系统、小血管壁等多种器官及组织，活化补体、多型核白细胞及血小板，致局部炎症及小血管炎，使血管阻塞，而显示为多种临床病症。如能通过T细胞免疫抑制自身反应性T淋巴细胞的活化，控制SLE的发展，可能是治疗SLE的理想方法。1981年Bennun等对Lewis大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimentalautoimmune encephalomyelitis，EAE）的研究时，从发病鼠淋巴组织分离到一株髓鞘碱性蛋白（Myelin basic protein，MBP）特异性的自身反应性T细胞。该细胞输给正常大鼠可诱发EAE，但若在转输前用放射线照射或用丝裂霉素处理的方法灭火该细胞，则受鼠反而获得对MBP免疫诱导的EAE的抵抗力。此时第一次提出T细胞疫苗（T cell vaccination）的概念，即用灭活或低于致病剂量的自身反应性T细胞或其T细胞受体（T cell receptor,TCR）多肽作为疫苗接种，诱导或触发调节网络产生特异性抑制作用，从而清除自身反应性T细胞，达到防治自身免疫性疾病的作用。近年来T细胞疫苗与自身免疫性疾病的关系得到广泛研究，T细胞疫苗在自身免疫性疾病中的应用也得到广泛关注。在多发性硬化、类风湿性关节炎、器官、组织移植术后，自身免疫性甲状腺炎，免疫性心肌炎等疾病的临床研究中均取得了令人满意的结果，为治疗难治性自身免疫性疾病的治疗提供了新思路。本课题即运用T细胞疫苗免疫的方法对SLE动物模型BXSB鼠进行试验性治疗，分析有关实验室指标变化，旨在为T细胞疫苗临床治疗系统性红斑狼疮提供实验依据。目的1、用BXSB鼠脾细胞制备T细胞疫苗。2、观察T细胞疫苗免疫前后BXSB鼠24小时尿蛋白定量、血清ANA抗体、ds-DNA抗体水平的动态变化，从而探讨T细胞疫苗免疫在一定时间内对BXSB鼠病情的影响。3、观察T细胞疫苗免疫前后BXSB鼠血清IL-18水平动态变化，从而探讨T细胞疫苗免疫在一定时间内对BXSB鼠免疫状态影响的有关机制。方法1、实验动物雄性BXSB鼠12只。随机分为2组。A组为2只，用来制备T细胞疫苗。B组10只，实验组，用来观察T细胞疫苗对BXSB鼠的影响。2、BXSB鼠脾脏淋巴细胞分离：无菌条件下将BXSB鼠脾脏取下，制成脾细胞悬液，加入淋巴细胞分离液，离心，取淋巴细胞，用Hanks液清洗2次，最后用RPMI1640培养液调整细胞浓度到1×108／ml。台盼兰染法鉴定活细胞数>95％。3、T细胞疫苗的制备用完全培养液调整细胞至2×105／ml，加伴刀豆球蛋白A（ConA）混合后移置5％CO237℃孵箱中培养48h后收集细胞，然后加入丝裂霉素C（mitomycin C）处理细胞，PBS洗涤后，用RPMI1640培养液调整细胞至1×108／ml备用。4、T细胞疫苗皮下免疫：取1×107细胞皮下免疫BXSB鼠，每周1次，连续3次，并于免疫前和首次免疫后第1w、2w、4w观察有关指标变化。5、观察指标及检测方法：于免疫前和首次免疫后第1w、2w、4w将BXSB鼠断尾取血，分离血清，ELISA法测血清ANA抗体、ds-DNA抗体和IL-18水平。用代谢笼收集BXSB鼠24小时尿量，考马斯量蓝染色法检测24小时尿蛋白定量。结果1、T细胞疫苗免疫前后BXSB鼠24小时尿蛋白定量差异有显著意义（F=22．177，P=0．000），呈递减趋势。免疫后1w、2w、4w均低于免疫前。免疫后1w与免疫前无显著差异（P=0．519），而免疫后2w和4w水平显著低于免疫前和免疫后1w（P<0．05），且免疫后4w水平低于免疫后2w（P=0．037）。2、T细胞疫苗免疫前后BXSB鼠血清ANA抗体水平差异有显著意义（F=15．757，P=0．000），呈下降趋势。免疫后1w、2w、4w均低于免疫前。免疫后1w与免疫前无显著差异（P=0．317），而免疫后2w和4w水平明显低于免疫前和免疫后1w（P<0．05），但两者之间无显著差异（P=0．072）。3、T细胞疫苗免疫前后BXSB鼠血清ds-DNA抗体水平有显著差异（F=16．735，P=0．000），呈下降趋势。免疫后1w、2w、4w均低于免疫前。免疫后1w与免疫前无显著差异（P=0．569），而免疫后2w和4w水平显著低于免疫前和免疫后1w（P<0．05），但两者之间无显著差异（P=0．056）。4、T细胞疫苗免疫前后BXSB鼠血清IL-18水平差异有显著性意义（F=34．583，P=0．000），呈递减趋势。免疫后1w、2w、4w均低于免疫前。免疫后1w与免疫前无显著差异（P=0．130），而免疫后2w和4w水平显著低于免疫前和免疫后1w（P<0．05），免疫后4w水平继续降低，显著低于免疫后2w（P=0．006）。5、首次免疫后4w，其中1只BXSB鼠死亡。结论1、T细胞疫苗免疫BXSB鼠后2周其24小时尿蛋白定量、自身抗体水平即开始下降，免疫后4w仍维持较低水平。从而推测T细胞疫苗在一定时间内可抑制BXSB鼠B细胞活化，减少自身抗体的产生，减轻肾脏损伤，延缓病情发展。2、T细胞疫苗免疫BXSB鼠后2周其血清IL-18水平开始显著降低，免疫后4w继续降低。提示T细胞疫苗在调节免疫细胞及细胞因子的相互联系中有重要作用。3、T细胞疫苗治疗BXSB鼠有一定的有效性和安全性。为T细胞疫苗的临床应用提供了实验依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 T细胞疫苗对BXSB鼠24小时尿蛋白定量、血清ANA抗体、ds-DNA水平的影响
• 前言
• 1.1 材料和方法
• 1.2 统计学方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 参考文献
• 第二章 T细胞疫苗对BXSB鼠血清IL-18水平的影响
• 2.1 材料与方法
• 2.2 统计学方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 参考文献
• 第三章 全文总结
• 3.1 研究背景
• 3.2 研究方法
• 3.3 结果
• 3.4 结论
• 3.5 新的研究方向
• 中英文缩写词对照表
• 综述 小鼠IL-18 ELISA试剂盒说明书
• 成果
• 致谢