论文题目: TPO受体胞内区相互作用蛋白的筛选与初步功能研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 放射医学
作者: 刘红岩
导师: 毛秉智,陈家佩,从玉文
关键词: 相互作用,酵母双杂交文库筛选
文献来源: 中国人民解放军军事医学科学院
发表年度: 2005
论文摘要: TPO是重要的造血生长因子,主要调控巨核细胞的增殖和血小板的生成,并能与其它因子协同作用,支持多能造血祖细胞的存活和分化。TPO通过与细胞膜上的TPO受体(Mpl)结合而发挥作用,研究Mpl的信号转导过程对理解TPO广泛的生理作用有重要意义。 当TPO与Mpl结合时,Mpl形成同源二聚体,激活与之结合的Janus激酶(JAK2),引起受体胞内区酪氨酸残基的磷酸化,从而引发下游STAT、Ras/Raf/MAPK、PI3K等多条信号转导通路。研究发现缺失c-Mpl胞内区近膜的10个氨基酸,TPO与c-Mpl结合便不能激活JAK2,但Raf、MAPK、PI3K仍可被激活;而去除Mpl胞内区所有酪氨酸残基,TPO仍可支持TPO依赖细胞株的增殖,这些都说明细胞内尚存在其他未被认识的TPO受体信号转导通路。寻找新的介导TPO信号的蛋白质是本研究的目的。 我们以Mpl胞内区蛋白为诱饵,利用酵母双杂交的方法从小鼠胎肝文库中钓取了16个可能同Mpl胞内区存在相互作用的基因片段;然后通过哺乳动物细胞内双杂交实验进一步筛选,去除其中2个在此系统下同Mpl没有相互作用的片段;在剩余的14个基因片段中,通过对基因的功能和细胞内定位分析,选取了8个可能同Mpl胞内区存在相互作用的基因片段继续研究,克隆了此8个基因片段的全长序列,并利用哺乳动物细胞内双杂交实验对全长基因同Mpl的相互作用进行验证,结果这8个全长基因同Mpl胞内区均存在相互作用。我们选取其中的两条基因(RACK1和Atp5d)进行了进一步研究。 RACK1是激活的PKC的受体,具有衔接蛋白的功能,已证实与许多信号分子及受体存在相互作用,可能在细胞信号转导中起组织、聚集、调控信号分子的作用。通过Western blot实验检测RACK1在不同组织与细胞内的表达情况,发现在表达Mpl的细胞和组织内RACK1的表达也很丰富;通过免疫共沉淀实验确定了在转染细胞内RACK1同Mpl胞内区存在相互作用;随后进一步用激光共聚焦
论文目录:
摘要
前言
第一部分 TPO受体胞内区相互作用蛋白的筛选
一.酵母双杂交文库的筛选
1.材料与方法
2.实验结果
3.结论
二.候选基因片断的进一步筛选
1.材料与方法
2.实验结果
3.结论
三.筛选基因全长的克隆及其与MPL在哺乳动物细胞内相互作用的确定
1.材料与方法
2.实验结果
3.结论
总结
讨论
第二部分 RACK1与MPL相互作用的研究
一.RACK1同MPL相互作用的确定
1.材料与方法
2.实验结果
3.结论
二.RACK1在TPO受体信号转导中的初步功能研究
1.材料与方法
2.实验结果
3.结论
总结
讨论
第三部分 ATP5D与MPL相互作用的研究
一.ATP5D基因的原核表达及抗体制备
1.材料与方法
2.实验结果
3.结论
二.ATP5D同MPL相互作用的确定
1.材料与方法
2.实验结果
3.结论
三.ATP5D同MPL结合部位的确定
1.材料与方法
2.实验结果
3.结论
总结
讨论
总结
参考文献
致谢
附录1 英文缩略词表
附录2 溶液的配制
文献综述
博士期间发表论文
发布时间: 2005-09-05
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标签：相互作用论文; 酵母双杂交文库筛选论文;