重组纤维素结合域的吸附特性及纸浆增强作用

论文摘要

本文根据来自于草菇cbh 1-1（CBD1）和热纤梭菌的cipB（CBM3）的CBD序列设计了—系列相互重叠的引物,利用PCR的方法得到含双纤维素结合域的基因片段。通过限制性内切酶酶切连接后与表达质粒pET-32b相连,再转入大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达。SDS-PAGE检测到四种目的蛋白CBM3-GS-CBD1、CBM3-celc-CBD1、CBM3-GS-CBM3、CBD1-celc-CBD1均能正确表达。CBD1-celc-CBD1仅在诱导温度降低至20℃时才会出现可溶性表达,其余重组蛋白在30℃时即可得到可溶性蛋白。采用NI-NTA亲和纯化的方法得到了纯化的目的蛋白,比较它们对Avice1、磷酸润涨纤维素、Whatman 1号滤纸及纸浆的吸附特性：（1）家族1 CBD对结晶型纤维素吸附量最高,其中CBD1-celc-CBD1对Wicel的吸附最大值为CBM3-GS-CBM3的三倍。CBM3-GS-CBD1则对磷酸润涨纤维素吸附最高,对（?）Whatman 1号滤纸吸附最多的为CBM3-celc-CBD1,对纸浆吸附量较高的为CBD1-celc-CBD1。（2）连接肽（linker）也对吸附有一定的影响,含有弹性linker的CBM3-GS-CBD1更倾向于吸附Avicel,而含有草菇外切-β-葡聚糖酶CBH I-I native linker的CBM3-celc-CBD1吸附Whatman 1号滤纸能力更强。（3）此外,我们研究了四种蛋白对（?）Wicel吸附的可逆性,其中仅有CBD1-celc-CBD1的吸附是可逆的。在对纸张机械性能的影响上,CBM3-GS-CBM3对纸张耐折度和抗张强度的增加最为明显,分别提高了27.4%和15.5%。CBD1-celc-CBD1也有16.7%和12.6%的提高。CBM3-GS-CBD1、CBM3-celc-CBD1对纸浆有一定的助滤作用。经四种蛋白处理的纸张防水性均有提高。本论文首次系统的研究了草菇CBH I-I的CBD和热纤梭菌CipB的CBD的吸附特性及差异,和它们在纸张性能改善方面的应用。同时,首次比较了不同构造的连接肽对双CBD融合蛋白的影响。以上结果显示,重组蛋白可用于改善纸品纤维的表面性质和机械性能。此外,家族1的CBD能够可逆性吸附纤维素这一特点还可用于纤维再利用。本文为开发一种新型生物纸浆增强剂提供了理论依据和实践基础。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 纤维素酶
• 1.1.1 纤维素酶的组成及分类
• 1.1.2 纤维素酶的结构
• 1.2 连接肽（linker）
• 1.3 纤维素结合域（CBD）
• 1.3.1 CBD的来源和分类
• 1.3.2 CBD的结构和功能
• 1.3.2.1 来自家族1和3的CBD
• 1.3.3 CBD的应用
• 1.3.3.1 CBD在纤维修饰及造纸工业的应用
• 1.3.3.2 CBD在固定化、亲和层析及蛋白质工程上的应用
• 1.4 论文的研究意义和研究目的
• 第二章 包含双CBD基因片段重组质粒的构建
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 质粒
• 2.1.3 药品
• 2.1.4 工具酶
• 2.1.5 仪器
• 2.1.6 培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 cbm3基因的人工合成
• 2.2.2 dCBD重组基因的合成
• 2.2.2.1 cbm3-gs-cbd1的合成
• 2.2.2.2 cbm3-celc-cbd1的构建
• 2.2.2.3 cbm3-gs-cbm3的构建
• 2.2.2.4 cbd1-celc-cbd1的构建
• 2.2.3 基因片段与T载体PCR2.1连接
• 2.2.4 重组质粒dCBD-PCR2.1转化大肠杆菌
• 2.2.5 重组质粒dCBD-PCR2.1阳性克隆的筛选
• 2.2.6 重组表达质粒dCBD-pET 32b的构建及筛选
• 2.3 结果
• 2.3.1 cbm3基因片段的构建
• 2.3.2 目的基因的构建
• 2.3.2.1 cbm3-gs-cbd1的合成
• 2.3.2.2 cbm3-celc-cbd1的合成
• 2.3.2.3 cbm3-gs-cbm3的合成
• 2.3.2.4 cbd1-celc-cbd1的合成
• 2.3.3 重组质粒dCBD-PCR2.1阳性克隆的筛选
• 2.4 重组表达质粒dCBD-pET 32b的构建
• 2.5 讨论
• 2.6 本章小结
• 第三章 重组蛋白表达及可溶性研究
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 培养基
• 3.1.4 缓冲液
• 3.2 方法
• 3.2.1 重组表达菌株的构建
• 3.2.2 重组蛋白的表达
• 3.2.3 表达结果的SDS-PAGE分析
• 3.2.3.1 溶液的配制
• 3.2.3.2 分离胶和浓缩胶的配制
• 3.2.3.3 样品的准备
• 3.2.3.4 加样
• 3.3.3.5 电泳
• 3.2.3.6 染色与脱色
• 3.2.4 目的蛋白可溶性表达最优条件的研究
• 3.2.4.1 不同温度对可溶性表达的影响
• 3.2.4.2 不同IPTG诱导浓度对可溶性表达的影响
• 3.2.5 Native条件下的亲和纯化验证
• 3.3 结果
• 3.3.1 重组表达菌株的构建
• 3.3.2 重组表达蛋白的诱导表达
• 3.3.3 重组表达蛋白的可溶性研究
• 3.3.3.1 CBM3-GS-CBD1的可溶性研究
• 3.3.3.2 CBM3-celc-CBD1的可溶性研究
• 3.3.3.3 CBM3-GS-CBM3的可溶性研究
• 3.3.3.4 CBD1-celc-CBDl的可溶性研究
• 3.3.4 IPTG浓度对蛋白可溶性表达的影响
• 3.3.5 重组蛋白的纯化
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 重组蛋白吸附性能的比较
• 4.1 材料
• 4.1.1 试剂
• 4.1.2 缓冲液
• 4.2 方法
• 4.2.1 重组蛋白吸附性能的研究
• 4.2.1.1 重组蛋白对不同底物吸附的研究
• 4.2.1.2 重组蛋白可逆性吸附的研究
• 4.3 结果
• 4.3.1 重组蛋白对不同底物的吸附
• 4.3.1.1 重组蛋白对Avicel的吸附
• 4.3.1.2 重组蛋白对磷酸润涨纤维素的吸附
• 4.3.1.3 重组蛋白对Whatman 1号滤纸的吸附
• 4.3.1.4 重组蛋白对纸浆的吸附
• 4.3.2 重组蛋白可逆性吸附的研究
• 4.4 讨论
• 4.4.1 重组蛋白吸附特性的研究
• 4.4.2 重组蛋白可逆性的研究
• 4.5 小结
• 第五章 重组蛋白及对纸张性能影响的初步研究
• 5.1 材料
• 5.1.1 缓冲液
• 5.1.2 仪器和设备
• 5.2 方法
• 5.2.1 蛋白浓度的测定
• 5.2.2 打浆
• 5.2.3 抄片
• 5.2.4 纸张机械性能的测定
• 5.2.4.1 耐折度的测定
• 5.2.4.2 抗张强度的测定
• 5.2.4.3 耐破度的测定
• 5.2.5 滤水速度的测定
• 5.2.6 纸张防水性的测定
• 5.3 结果
• 5.3.1 蛋白浓度的测定
• 5.3.2 重组蛋白对纸张耐折度的影响
• 5.3.3 重组蛋白对纸张抗张强度的影响
• 5.3.4 重组蛋白对纸张耐破度的影响
• 5.3.5 重组蛋白对纸浆滤水性的影响
• 5.3.6 重组蛋白对纸张防水性的影响
• 5.4 讨论
• 5.4.1 重组蛋白对纸张性能的影响
• 5.4.2 重组蛋白对纸张滤水性的影响
• 5.4.3 重组蛋白对纸张防水性的影响
• 5.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 详细摘要
• Abstract