冬凌草甲素的微粒制剂和药动学研究

论文摘要

冬凌草甲素为抗癌中药冬凌草中的主要抗癌活性成分，具有资源丰富、毒性低、药理活性强等优势，近年来吸引了广大药学工作者的注意。但目前对于该药的研究主要集中在药理活性方面，对于其制剂研究较少，并且不系统，目前也没有合适的制剂投放到市场。本文从制剂学角度对冬凌草甲素进行了系统的研究。通过对冬凌草甲素的理化性质和初步的药物动力学研究，解析了冬凌草甲素的体内外性质，并据此对冬凌草甲素的制剂进行了筛选。通过对羟丙基-β-环糊精复合物、注射用亚微乳、固体脂质纳米颗粒和脂质体这四种微粒制剂的考察和比较，研制出冬凌草甲素羟丙基-β-环糊精复合物和冬凌草甲素脂质体，并对这两种制剂进行体内外评价。首先，本文对冬凌草甲素的理化性质进行了考察，侧重于平衡溶解度、油水分配系数和稳定性。冬凌草甲素在水、常用油中的溶解度较差；具有中等的疏水性；在溶液状态时对光、热的稳定性较差，在碱性条件下稳定性更差，不能长期放置。通过测定该药以及降解产物的红外光谱推测该药的活性基团α-亚甲基环戊酮遭到破坏。根据冬凌草甲素的理化性质，对文献关于冬凌草甲素的提取纯化工艺进行改进，采用浸渍法提取虽提取率稍低，但出膏率明显降低，有利于纯化；用硅胶柱提取时，缩短柱长，提高上样量，以利于药物晶体的析出。改进后的工艺可以提高冬凌草甲素的产率和纯度。其次，测定了冬凌草甲素溶液在大鼠体内的药动学和在小鼠体内的分布。大鼠静脉注射冬凌草甲素溶液后，血药浓度迅速下降，然后呈现4～6h的平台，接着是缓慢消除，消除半衰期约为10h。在所测定的给药剂量范围内（5～15mg／kg）冬凌草甲素的药物动力学特征呈非剂量依赖性。大鼠静脉注射冬凌草甲素溶液后（给药剂量为10mg／kg）有大约相当于给药剂量16.4％的冬凌草甲素以原型从胆汁中排泄，并且主要发生在前6个小时，提示存在肝肠循环，药时曲线的平台可能是肝肠循环造成的。大鼠灌胃给予冬凌草甲素溶液后血浆中药物浓度迅速升高，很快达到峰值，但绝对生物利用度很低，并且在实验所测定的范围内呈现出剂量依赖性，高剂量是低剂量和中剂量的两倍多。大鼠口服冬凌草甲素溶液后，48 h内以粪便形式排泄量和肠内容物的量只占给药剂量的6.52％，表明造成大鼠口服冬凌草甲素溶液绝对生物利用度低的原因可能是首过效应，而剂量依赖现象则是由于首过代谢饱和所造成的。大鼠腹腔注射冬凌草甲素溶液后（给药剂量为10 mg／kg）的绝对生物利用度为12.64％，表明冬凌草甲素有强的肝首过代谢。灌胃给予冬凌草提取液后（给药剂量相当于冬凌草甲素40 mg／kg）冬凌草甲素的绝对生物利用度仍很低，只有11.4％，但较给予相同剂量的冬凌草甲素溶液提高了1.5倍，表明冬凌草甲素中的其它成分可能影响冬凌草甲素的吸收。小鼠静脉注射冬凌草甲素溶液后分布广泛，在心、肺和肾中分布较高，但在心脏中消除很快，在脑中分布很低。最后，对冬凌草甲素的制剂进行了研究。考虑到该药口服生物利用度低，所以主要考察静脉注射制剂。因为冬凌草甲素的水溶性差，而使用有机溶剂增溶会增强毒副作用并降低患者的顺应性，所以我们研究了不含有机溶剂的微粒制剂，包括羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）复合物、注射用亚微乳、脂质纳米颗粒和脂质体。HP-β-CD可以增加冬凌草甲素在水中的溶解度，可以满足临床给药的需要，对于该药在溶液中的稳定性差无改善，但将复合物制成粉针后解决了冬凌草甲素稳定性差的问题。大鼠静脉注射冬凌草甲素-HP-β-CD后该药的分布稍快于普通溶液，消除速度无差别；在小鼠体内分布实验表明注射复合物增加了肺中的药物浓度并稍降低了在心脏中的浓度。初步安全性实验表明该复合物适于静脉注射给药。对冬凌草甲素制成注射用亚微乳、固体脂质纳米颗粒和脂质体的可行性进行了分析，采用单相溶液冻干法将冬凌草甲素制成前体脂质体可获得较高的包封率并且解决了药物稳定性差的问题。通过处方优化确定单相溶液冻干法制备冬凌草甲素的处方、工艺。得到的脂质体平均粒径为119nm，分布均匀，包封率约为63％，放置12 h内包封率没有明显下降，无药物晶体析出。初步的制剂安全性实验表明冬凌草甲素脂质体静脉注射不会导致溶血，无刺激性，适合静脉注射给药。大鼠药动学实验表明冬凌草甲素脂质体药动学行为不同于注射冬凌草甲素溶液，分布变快但是消除变慢，消除半衰期延长了约1倍，药时曲线下面积增加了66.5％。小鼠静脉注射冬凌草甲素脂质体后的组织分布研究表明药物在心脏中的分布下降，在5 min时为注射溶液的1半；在肝中的分布上升，在5 min时是注射溶液的4倍，在1h是注射溶液的4.3倍；在脾和肺中的分布稍有降低，但在脑中的分布提高了约1倍。结果表明冬凌草甲素脂质体可能降低药物的毒性并利于肝癌的治疗。根据理化性质推测该脂质体可能会取得较好的肿瘤靶向性。

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前言

第一章冬凌草甲素的理化性质研究

1.材料与仪器

2.实验方法和结果

2.1 冬凌草甲素体外分析方法的建立和确证

2.1.1 检测波长的选择

2.1.2 色谱条件

2.1.3 标准曲线的制备

2.1.4 系统精密度

2.2.冬凌草甲素在各种溶剂中的平衡溶解度测定

2.2.1 测定方法

2.2.2 冬凌草甲素在不同pH值磷酸盐缓冲液中的平衡溶解度

2.2.3 冬凌草甲素在有机溶剂中的平衡溶解度

2.2.4 冬凌草甲素在油中的平衡溶解度

2.3.表观油水分配系数测定

2.4.溶液稳定性研究

2.4.1 冬凌草甲素降解产物的考察

2.4.2 冬凌草甲素溶液稳定性测定方法

2.4.3 冬凌草甲素在70℃和100℃时在不同溶液中的稳定性结果

2.4.4 光照对冬凌草甲素溶液稳定性的影响

2.4.5 冬凌草甲素固态时稳定性考察

3.讨论

4.本章小结

5.参考文献

第二章冬凌草甲素的提取和纯化

1.材料与仪器

2 实验方法与结果

2.1 冬凌草甲素提取纯化工艺考察

2.1.1 提取

2.1.2 浓缩和脱色

2.1.3 分离

2.2 优化后的冬凌草甲素提取纯化工艺

2.2.1 优化后的冬凌草甲素提取纯化工艺

2.2.2 冬凌草甲素提取纯化工艺流程图

2.3 冬凌草甲素的鉴定

3.讨论

4.本章小结

5.参考文献

第三章冬凌草甲素在大鼠体内的药物动力学研究

1.材料与仪器

2.实验方法和结果

2.1 冬凌草甲素系列标准溶液及内标溶液的配制

2.2 分析方法的确立

2.2.1 色谱和质谱条件

2.2.2 血浆样品预处理

2.2.3 方法的专属性考察

2.2.4 标准曲线和线性范围

2.2.5 方法的精密度与准确度

2.2.6 提取回收率考察

2.2.7 样品稳定性考察

2.2.8 血浆样品的测定

2.3 分析方法的优化

2.3.1 质谱条件的优化

2.3.2 色谱条件的优化

2.3.3 样品预处理方法的优化

2.3.4 内标的选择

2.4 大鼠静脉注射冬凌草甲素溶液的药物动力学

2.4.1 给药方案和样品采集

2.4.2 药动学参数计算

2.4.3 测定结果

2.5 大鼠口服冬凌草甲素溶液的药动学研究

2.5.1 给药方案和样品采集

2.5.2 药动学参数计算

2.5.3 测定结果

2.6 大鼠灌胃给予冬凌草提取物溶液后冬凌草甲素的药动学研究

2.6.1 冬凌草提取液的配制

2.6.2 给药方案、样品采集和药动学参数计算

2.6.3 测定结果

2.7 大鼠腹腔注射冬凌草甲素溶液后的药动学研究

2.7.1 给药方案、样品采集和药动学参数计算

2.7.2 测定结果

3.讨论

4.本章小结

5.参考文献

第四章冬凌草甲素的分布和排泄研究

1.材料与仪器

2.实验方法和结果

2.1 冬凌草甲素在小鼠体内的分布研究

2.1.1 给药方案和样品采集

2.1.2 样品的预处理

2.1.3 色谱和质谱条件

2.1.4 标准曲线的制备

2.1.5 样品测定和结果

2.2 大鼠口服冬凌草甲素溶液后的粪排泄研究

2.2.1 给药方案和样品采集

2.2.2 标准曲线的制备

2.2.3 样品的测定

2.2.4 测定结果

2.3 大鼠静脉注射冬凌草甲素溶液后的胆汁排泄

2.2.1 给药方案和样品采集

2.2.2 标准曲线的制备

2.2.3 样品的测定

2.2.4 测定结果

3.讨论

4.本章小结

5.参考文献

第五章冬凌草甲素-HP-β-CD复合物的体内外评价

1.材料与仪器

2.实验方法和结果

2.1 HP-β-CD对冬凌草甲素的增溶作用

2.1.1 溶液中冬凌草甲素的含量测定

2.1.2 三种HP-β-CD对冬凌草甲素增溶作用的比较

2.1.3 HP-β-CD对冬凌草甲素的增溶实验

2.1.4 HP-β-CD对冬凌草甲素的增溶实验结果

2.2 冬凌草甲素-HP-β-CD复合物的制备

2.3 冬凌草甲素-HP-β-CD复合物的确证

2.3.1 X射线粉末衍射

2.1.2 DSC分析

2.1.3 紫外分光光度法分析

2.1.4 红外光谱法分析

2.1.5 核磁共振氢谱分析

2.4 HP-β-CD对冬凌草甲素稳定性影响

2.4.1 HP-β-CD对冬凌草甲素溶液稳定性影响

2.1.2 HP-β-CD对冬凌草甲素溶液稳定性影响

2.5 HP-β-CD对冬凌草甲素在大鼠体内药动学的影响

2.5.1 给药方案和样品采集

2.5.2 大鼠血浆样品的预处理

2.5.3 测定结果

2.6 HP-β-CD对冬凌草甲素在小鼠体内分布的影响

2.6.1 给药方案和样品采集

2.6.2 样品的预处理及测定方法

2.6.3 测定结果

2.7 冬凌草甲素-HP-β-CD复合物安全性初步考察

2.7.1 急性毒性的初步考察

2.7.2 血管刺激性实验

2.7.3 体外溶血实验

3.讨论

4.本章小结

5.参考文献

第六章冬凌草甲素脂质载药系统的研究

1.材料与仪器

2.冬凌草甲素脂质载药系统的初步考察

2.1 冬凌草甲素注射用亚微乳的考察

2.2 冬凌草甲素固体脂质纳米颗粒的考察

2.3 冬凌草甲素脂质体的考察

2.3.1 薄膜法

2.3.2 注入法

2.3.3 单相溶液冻干法

3.单相溶液冻干法制备冬凌草甲素脂质体的工艺研究

3.1 处方和工艺的初步确定

3.1.1 磷脂种类的选择

3.1.2 叔丁醇的用量的考察

3.1.3 磷脂用量的考察

3.1.4 水溶性载体的选择

3.1.5 水化时加入水的用量考察

3.1.6 水化时加入水的温度考察

3.1.7 预冻温度的考察

3.1.8 冻干时间的确定

3.2 采用正交实验对处方和工艺进行优化

3.2.1 因素和水平的确立

3.2.2 正交实验

3.2.3 验证实验

3.3 进一步优化工艺处方

4.冬凌草甲素脂质体理化性质研究

4.1 外观

4.2 粒径大小及分布

4.3 ζ电位测定

4.4 包封率测定

4.5 冬凌草甲素在前体脂质体中的存在状态

5.冬凌草甲素脂质体在大鼠体内的药动学研究

5.1 给药方案、样品采集和测定

5.2 测定结果

6.冬凌草甲素脂质体在小鼠体内的分布研究

6.1 给药方案和样品采集

6.2 样品的预处理及测定

6.3 测定结果

7.冬凌草甲素脂质体的安全性初步考察

7.1 急性毒性的初步考察

7.2 血管刺激性实验

7.3 体外溶血实验

8.讨论

9.本章小结

10.参考文献

全文结论

致谢

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