黄颡鱼金属硫蛋白cDNA克隆及原核表达

论文摘要

金属硫蛋白普遍存在于生物体内,具有低分子量、富含半胱氨酸、诱导性强等特点。金属硫蛋白具有很强的金属结合能力和氧化还原能力,在生物体内参与细胞内金属水平的稳态调节、重金属解毒、清除自由基、抵抗电离辐射等,具有较强的生物学功能。本论文通过同源克隆和RACE等方法克隆了黄颡鱼MT全长cDNA序列。该序列全长381 kb,开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）长度为183 bp,可以编码60个氨基酸,推导的氨基酸序列与其他已知鱼类MT具有80%以上的相似性（identity）,序列比对和聚类分析表明黄颡鱼MT与斑点叉尾鮰MT氨基酸序列相似性最高（91%）。理论分子量为6080Da。在其编码的氨基酸序列中半胱氨酸（Cys）含量最高,占33.3%,其次是丝氨酸（Ser）占18.3%,赖氨酸（Lys）占11.67%,不含组氨酸和芳香族氨基酸。对其编码的氨基酸序列进行分析发现该序列有脊椎动物金属硫蛋白的保守序列模式cys-x-cys、cys-x-x-cys和cys-x-cys-cys。在半定量试验中,用β-actin基因做内参,用比较电泳条带亮度比值得方式进行分析,表明MT会受到Cd2+的诱导表达并与其浓度相关,MT在肝脏中表达量相对较高。本论文采用基因重组技术,将黄颡鱼MT基因重组入原核表达载体pMAL-c2x中,该载体含有一个麦芽糖结合蛋白（MBP）基因,便于融合蛋白表达后的纯化。将重组质粒转入E.coli BL21中进行体外表达,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导后成功地表达了目的融合蛋白MBP-MT。对MT的重金属离子（Zn2+,Cd2+）耐受性进行了研究,转化MT的大肠杆菌BL21与对照相比,对重金属耐受性都得到了增加。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 金属硫蛋白的结构与生物学特性
• 1.2 金属硫蛋白的主要功能
• 1.2.1 重金属解毒作用
• 1.2.2 参与微量元素的储存、运输和代谢
• 1.2.3 清除羟自由基,拮抗电离辐射
• 1.2.4 参与激素和发育调节,增强机体应激反应
• 1.2.5 MT的免疫调节作用
• 1.2.6 MT在细胞凋亡中的作用
• 1.3 MT的应用
• 1.4 MT分子生物学研究进展
• 1.5 研究目的和意义
• 第2章 黄颡鱼金属硫蛋白cDNA的克隆与序列分析
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 仪器与试剂
• 2.2.3 方法
• 2.2.3.1 黄颡总RNA的提取
• 2.2.3.2 RT-PCR
• 2.2.3.3 黄颡鱼金属硫蛋白基因cDNA的克隆
• 2.2.3.4 PCR产物的回收
• 2.2.3.5 PCR产物克隆到大肠杆菌
• 2.2.3.6 黄颡鱼MT cDNA 3'-RACE和5'-RACE
• 2.2.3.7 序列分析
• 2.2.3.8 半定量实验
• 2.3 结果
• 2.3.1 黄颡总RNA的提取
• 2.3.2 黄颡MT基因片段克隆
• 2.3.3 黄颡鱼MT cDNA 3'-RACE和5'-RACE
• 2.3.4 黄颡鱼MT cDNA序列拼接及全序列分析
• 2.3.5 黄颡鱼MT的分子系统进化分析
• 2.3.6 半定量实验
• 2.4 讨论
• 第3章 黄颡鱼MT基因的原核表达
• 3.1 引言
• 3.2 材料
• 3.2.1 菌株与质粒
• 3.2.2 主要试剂与酶
• 3.3 方法
• 3.3.1 引物设计
• 3.3.2 PCR扩增目的片段
• 3.3.3 pMAL-c2x质粒抽提
• 3.3.4 pMAL-c2x-MT重组质粒的构建
• 3.3.4.1 PCR产物酶切
• 3.3.4.2 pMAL-c2x质粒酶切
• 3.3.4.3 连接
• 3.3.4.4 大肠杆菌BL21感受态细胞的制备
• 3.3.4.5 酶切产物连接液的转化
• 3.3.4.6 阳性克隆的PCR鉴定
• 3.3.5 诱导表达
• 3.3.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 3.3.6.1 样品处理
• 3.3.6.2 SDS-PAGE操作
• 3.3.7 两种金属离子对表达MT的大肠杆菌生长的影响初步研究
• 3.4 结果
• 3.4.1 PCR扩增目的基因
• 3.4.2 pMAL-c2x质粒抽提及酶切
• 3.4.3 双酶切鉴定重组质粒pMAL-c2x-MT
• 3.4.4 重组质粒测序结果
• 3.4.5 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 3.4.6 两种金属离子对表达MT的大肠杆菌生长的影响初步研究
• 3.5 讨论
• 第4章 结语
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间已发表论文情况
• 致谢