基因工程菌株里氏木霉合成t-PA发酵条件及r-PA基因在甲醇毕赤酵母中表达的研究

论文题目: 基因工程菌株里氏木霉合成t-PA发酵条件及r-PA基因在甲醇毕赤酵母中表达的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 发酵工程

作者: 冮洁

导师: 杜连祥

关键词: 组织型纤溶酶原激活剂,里氏木霉,甲醇毕赤酵母,突变体,表达系统,发酵动力学,分离纯化,酶学性质

文献来源: 天津科技大学

发表年度: 2005

论文摘要: 论文首先以基因工程菌株里氏木霉(Trichoderma reesei)为研究对象,对其生物合成组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator,t-PA)的发酵条件和发酵动力学进行了研究,并对里氏木霉重组t-PA的分离纯化及其性质进行了探索;然后进行了t-PA突变体的研究,获得了t-PA突变体r-PA基因,并在甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)中进行了表达。 采用稀释平板分离法对基因工程菌株Trichoderma reesei进行了分离纯化,对平板上生长良好的单菌落进行摇瓶液态发酵,以t-PA的酶活力为指标,挑选高产菌株,选得的Trichoderma reesei(8)号菌株t-PA产量最高,且遗传稳定性良好。 对Trichoderma reesei(8)生物合成组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的代谢调节机制进行了研究。在基础发酵条件下,L-山梨糖、D-蔗糖、可溶性纤维素、CMC、麦芽糖、乳糖和棉子糖等单糖及多糖对t-PA生物合成都有诱导作用,其中L-山梨糖的诱导效果最好,加量以1.0%为宜。葡萄糖及其中间代谢产物对t-PA的生物合成产生分解代谢物阻遏作用。纤维二糖在低浓度时可以促进t-PA的生物合成而在高浓度时对t-PA生物合成起反馈阻遏作用。 应用单因素和正交设计试验法,确定了种子培养基的最佳组成和最佳培养条件。应用正交设计试验法和响应面分析试验法优化出摇瓶分批发酵培养基的最佳组成。通过研究不同发酵条件对t-PA生物合成的影响,获得了最佳摇瓶分批发酵培养条件。优化条件与初始条件的摇瓶分批发酵比较试验结果表明,Trichoderma reesei(8)菌株在优化条件下的t-PA产量(3275.26U/mL)比初始条件下(1.14U/mL)显著提高。 对5L发酵罐上的分批发酵过程进行了分析。选择了适宜发酵条件并以5L发酵罐分批发酵试验数据为依据,采用MATLAB工具软件,利用全局收敛的修正的高斯-牛顿法算法,以误差平方和最小为目标,获得发酵动力学方程待估参数,建立了发酵动力学模型。通过拟合分析证明得到的数学模型误差较小,能较好的反映t-PA的分批发酵过程。 对里氏木霉重组t-PA的分离纯化方法进行了研究,建立了里氏木霉重组t-PA的分离提纯工艺。通过超滤、硫酸铵盐析、Butyl Sepharose 4 F F疏水层析、Sephadex G-25凝胶过滤脱盐、Q-Sepharose F F离子交换层析分离等分离步骤,里氏木霉重组t-PA的比活力由347.78U/mg提高到10619.58U/mg,提纯倍数30.54,活力回收率2.63%。通过SDS-PAGE电泳对各步纯化后样品进行分析,经上述各步将里氏木霉重组t-PA分离为电泳纯。 通过SDS-PAGE纤维蛋白自显影证明了Trichoderma reesei(8)的发酵液中

论文目录:

摘要

ABSTRACT

第一章 绪论

1.1 t-PA的结构与功能

1.1.1 t-PA的分子结构

1.1.2 t-PA的生理特性

1.1.3 t-PA的作用机制

1.1.4 t-PA的基因结构

1.2 t-PA的突变体

1.2.1 增强t-PA的酶原性和血纤维蛋白刺激作用

1.2.2 提高t-PA对血栓的亲和性

1.2.3 延长t-PA在体内的半衰期

1.2.4 抗PAI-1抑制

1.3 t-PA及其突变体的表达

1.3.1 t-PA及其突变体在大肠杆菌中的表达

1.3.2 t-PA及其突变体在哺乳动物细胞中的表达

1.3.3 t-PA及其突变体在酵母细胞中的表达

1.3.4 t-PA及其突变体在昆虫细胞中的表达

1.3.5 t-PA及其突变体在乳腺生物反应器中的表达

1.3.6 t-PA及其突变体在丝状真菌中的表达

1.4 其它溶栓剂

1.4.1 链激酶

1.4.2 尿激酶

1.4.3 对-甲氧苯甲酰纤溶酶原链激酶激活剂复合物

1.4.4 单链尿激酶型纤溶酶原激活剂

1.4.5 葡激酶

1.4.6 吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂

1.4.7 纳豆激酶

1.5 本论文的立题依据及主要研究内容

参考文献

第二章 Trichoderma reesei(8)生物合成t-PA摇瓶分批发酵条件的研究

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 菌种

2.2.2 主要仪器

2.2.3 主要试剂

2.2.4 主要溶液

2.2.5 培养基

2.2.6 实验方法

2.2.7 分析方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 t-PA高产菌株的分离纯化、筛选及稳定性测定

2.3.2 种子培养基及种子培养条件的优化

2.3.2.1 种子培养基中碳、氮源的确定

2.3.2.2 种子培养基中无机离子的筛选

2.3.2.3 Tween80对种子生长的影响

2.3.2.4 种子培养时间确定

2.3.2.5 斜面孢子接种量的影响

2.3.2.6 种子培养适宜初始pH的确定

2.3.2.7 种子培养适宜温度的选择

2.3.2.8 种子培养适宜装液量和转速的确定

2.3.2.9 适宜种子接种量的选择

2.3.3 Trichoderma reesei(8)生物合成t-PA的代谢调节

2.3.3.1 t-PA生物合成的诱导

2.3.3.2 分解代谢物对t-PA生物合成的阻遏作用

2.3.3.3 代谢产物对t-PA生物合成的反馈阻遏

2.3.4 发酵培养基组成的优化

2.3.4.1 碳源对t-PA合成的影响

2.3.4.2 氮源对t-PA合成的影响

2.3.4.3 发酵培养基中无机离子的筛选

2.3.4.4 表面活性剂的选择

2.3.4.5 响应面实验优化发酵培养基成分

2.3.5 摇瓶发酵条件的优化

2.3.5.1 适宜摇瓶发酵工艺参数的确定

2.3.5.2 摇瓶发酵过程动力学曲线

2.4 本章小结

参考文献

第三章 Trichoderma reesei(8)生物合成t-PA 5L罐分批发酵条件和动力学的研究

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 菌种

3.2.2 主要仪器

3.2.3 主要试剂

3.2.4 培养基

3.2.5 实验方法

3.2.6 分析方法

3.3 结果与讨论

3.3.1 5L发酵罐分批发酵条件控制

3.3.1.1 适宜溶氧的控制

3.3.1.2 适宜温度的控制

3.3.1.3 适宜pH值的控制

3.3.2 5L发酵罐分批发酵过程动力学曲线

3.3.3 分批发酵动力学模型的建立

3.3.3.1 动力学模型的选择

3.3.3.2 模型拟合分析

3.4 本章小结

参考文献

第四章 里氏木霉重组t-PA的分离纯化及其部分性质的鉴定

4.1 引言

4.1.1 蛋白质分离纯化常用的方法和原理

4.1.1.1 凝胶过滤色谱

4.1.1.2 离子交换色谱

4.1.1.3 反向色谱

4.1.1.4 疏水作用色谱

4.1.1.5 亲和层析

4.1.2 本实验的目的、主要内容和基本思路

4.2 材料与方法

4.2.1 主要材料

4.2.2 主要试剂

4.2.3 主要设备

4.2.4 主要溶液

4.2.5 实验方法

4.3 结果与讨论

4.3.1 超滤浓缩

4.3.2 硫酸铵盐析

4.3.3 疏水相互作用层析

4.3.3.1 Octyl Sepharose 4 Fast Flow

4.3.3.2 Butyl Sepharose 4 Fast Flow

4.3.4 Sephadex G-25凝胶过滤脱盐

4.3.5 离子交换层析

4.3.5.1 CM-Sepharose Fast Flow

4.3.5.2 Q-Sepharose High Performance

4.3.6 里氏木霉重组t-PA的纯化情况

4.3.7 SDS-PAGE纤维蛋白自显影

4.3.8 阴、阳纤维蛋白平板

4.3.9 冻融次数和保存时间对酶活力的影响

4.3.10 酶的温度稳定性

4.3.11 酶的pH稳定性

4.3.12 酶的最适作用温度

4.3.13 酶的最适作用pH

4.3.14 等电点的测定

4.4 本章小结

参考文献

第五章 r-PA基因的克隆及测序

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 菌株与质粒

5.2.2 引物

5.2.3 培养基

5.2.4 主要试剂

5.2.5 主要设备

5.2.6 主要溶液

5.2.7 实验方法

5.3 结果与讨论

5.3.1 基因工程菌里氏木霉染色体DNA的提取

5.3.1.1 DNA提取方法的比较

5.3.1.2 冷冻研磨CTAB法最佳条件的确定

5.3.2 r-PA cDNA的克隆

5.3.2.1 PCR扩增r-PA cDNA

5.3.2.2 重组质粒pMD18-r-PA的构建及筛选

5.3.2.3 重组质粒pMD18-r-PA的鉴定

5.3.3 r-PA cDNA序列的测定

5.4 本章小结

参考文献

第六章 r-PA基因表达载体的构建及其在甲醇毕赤酵母中的表达

6.1 引言

6.2 材料与方法

6.2.1 菌株与质粒

6.2.2 培养基

6.2.3 主要试剂

6.2.4 主要设备

6.2.5 主要溶液

6.2.6 实验方法

6.3 结果与讨论

6.3.1 r-PA基因表达载体的构建

6.3.1.1 质粒的双酶切

6.3.1.2 重组表达载体的连接、转化和筛选

6.3.1.3 pMETαA-r-PA的鉴定

6.3.2 电转化甲醇毕赤酵母

6.3.2.1 重组质粒pMETαA-r-PA的线性化

6.3.2.2 甲醇毕赤酵母PMAD16的生长曲线

6.3.2.3 电转化甲醇毕赤酵母电场强度的选择

6.3.3 酵母转化子的筛选及鉴定

6.3.3.1 酵母转化子的筛选

6.3.3.2 酵母转化子的PCR鉴定

6.3.3.3 酵母转化子表型的鉴定

6.3.4 基因工程菌株PMAD16-r-PA的生长曲线的测定

6.3.5 r-PA的诱导表达

6.3.6 表达产物的SDS-PAGE法检测

6.4 本章小结

参考文献

第七章 全文总结与展望

7.1 全文总结

7.2 本论文的创新点

7.3 展望

致谢

攻读博士学位期间发表论文情况

发布时间: 2007-01-10

参考文献

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• [2].里氏木霉铜代谢相关基因克隆与功能分析[D]. 傅科鹤.上海交通大学2013
• [3].木质纤维素优势降解菌株的酶学特性及其产物研究[D]. 熊莉丽.西南交通大学2014
• [4].草酸青霉木质纤维素降解酶系的解析及主要相关蛋白组分的功能研究[D]. 宋文霞.山东大学2016
• [5].纤维素酶转录调控因子及纤维素酶应用的研究[D]. 刘奎美.山东大学2016
• [6].里氏木霉纤维素酶诱导表达过程中碳源感应机制的研究[D]. 寇艳波.山东大学2015
• [7].木质纤维素对里氏木霉产纤维素酶的诱导[D]. 陆青山.南京林业大学2013
• [8].一种耐热碱性脂肪酶基因的克隆与表达[D]. 章旭.浙江大学2016
• [9].内切型-β-葡聚糖酶基因的克隆与表达[D]. 金欣.浙江大学2011
• [10].γ-TMT和FAD2基因在大肠杆菌与里氏木霉中的表达及鉴定[D]. TRAN VU HAI（陈武海）.华东理工大学2013

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• [3].人HSP70在毕赤酵母中的表达鉴定及大规模发酵和纯化工艺研究[D]. 马杰.吉林大学2005
• [4].纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌与毕赤酵母中的表达[D]. 黄志立.华南理工大学2001
• [5].粗糙脉孢菌漆酶基因的克隆、定点诱变及其在毕赤酵母中的表达[D]. 谌斌.江南大学2006
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• [7].根霉纤溶酶发酵过程优化及其溶栓作用的试验研究[D]. 刘东.天津科技大学2005
• [8].木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶基因的克隆及在甲醇毕赤酵母中的表达[D]. 王海宽.天津科技大学2005
• [9].重组基因工程抗体和蛇毒C型凝集素类似蛋白在毕赤酵母中表达及结构功能研究[D]. 胡思怡.中国科学技术大学2006
• [10].重组人HSP110在毕赤酵母中的表达及大规模发酵研究[D]. 徐煌.吉林大学2007

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