HarpinEccs蛋白诱导植物防卫反应的研究

论文摘要

本研究所使用的HarpinEccs是Erwinia carotovora subsp. carotovora CSDS001菌株的hrpNCSDS001基因在大肠杆菌基因工程菌JM109中经异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导表达的蛋白。本文主要从HarpinEccs蛋白质活性、生物学效应、生理生化和分子水平等方面对HarpinEccs诱导植物的防卫反应进行了相关研究和探讨。采用注射法检测HarpinEccs诱导非寄主植物的过敏反应（HR）和HarpinEccs的生物学活性,结果显示,300μg/mL HarpinEccs能够明显诱导烟草产生HR,在24h左右产生肉眼可见过敏焦斑,并且也能够诱导非寄主植物鸡冠花,玻璃海棠花产生HR,表明HarpinEccs具有一定的生物学活性。室内进行不同浓度的HarpinEccs防治烟草花叶病毒药效实验,结果显示,HarpinEccs能够诱导烟草产生明显的抗病性,其中以30μg/mL浓度处理的效果最明显,相对防效可达65.84%,且对TMV的诱导抗性持效期可超过30d,表明,施用HarpinEccs能有效诱导烟草对TMV的抗性,达到控制病害的目的。以浓度为30μg/mL的HarpinEccs处理烟草后,分别测定叶片中防卫反应相关酶的活性变化,结果表明,苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）活性都有不同程度的增强,三种酶活性高峰分别在处理后24h、24h和48h出现,分别比清水对照处理增加50%、132%和90.3%,其活性上升幅度类似或高于水杨酸（SA）处理。利用拟南芥全基因芯片从转录水平分析HarpinEccs诱导拟南芥基因表达谱变化。通过HarpinEccs和HarpinEa处理24h诱导拟南芥基因表达比对分析,结果显示,以HarpinEa为参照,HarpinEccs能够诱导拟南芥更加显著的基因表达差异。不同处理时间HarpinEccs诱导拟南芥基因表达差异分析结果显示,随着HarpinEccs处理时间延长（3h48h）,发生显著表达差异的基因数目逐渐增加,处理24h达到最大,然后缓慢下降,至处理48h基本趋于稳定,并维持在较高水平上,表明HarpinEccs诱导植物系统性获得抗性的产生是一个有时序的过程。Treeview聚类分析及木质素合成途径分析的结果显示,不同处理时间HarpinEccs诱导拟南芥中与木质素合成途径相关的基因部分表达上调,部分表达下调,其中AT5G04230和AT3G28200基因持续显著表达上调,此外木质素合成关键酶基因表达上调,表明HarpinEccs与诱导拟南芥木质素合成密切相关。通过对五种病程相关蛋白基因分析,结果显示,这些基因在HarpinEccs不同处理时间都有表达差异,尤其AT2G14610基因和AT1G75040基因显著表达上调。由以上推测HarpinEccs能够诱导拟南芥不同防卫反应信号通路的启动以及相关基因的差异表达,从而使植株获得抗病性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 环境对植物的调控及植物细胞信号转导
• 1.1 植物与环境的关系
• 1.2 环境刺激引发植物细胞信号转导
• 2 植物的抗病机制
• 2.1 结构抗性
• 2.2 固有的生理生化抗性
• 2.3 诱导的抗性
• 3 植物的抗病信号途径
• 3.1 水杨酸介导的抗病信号途径
• 3.2 茉莉酸和乙烯介导的抗病信号途径
• 4 hrp 基因及其产物Harpin 蛋白
• 4.1 hrp 基因与hrc 基因
• 4.2 hrp 基因的表达和调控
• 4.3 hrp 基因参与植物-病原细菌互作
• 4.4 hrp 基因表达产物：Harpin 蛋白
• 4.5 Harpin 蛋白的功能
• 4.6 Harpin 蛋白诱导植物产生系统性获得抗性
• 4.7 Messenger 的独特作用机理
• 5 本课题的研究目的和意义
• 6 本课题的研究内容
• 第二章 HarpinEccs 蛋白诱导非寄主植物的过敏反应
• 1 材料
• 1.1 供试植物
• 1.2 供试药剂
• 2 方法
• 2.1 过敏反应原理
• 2.2 HarpinEccs 诱导非寄主植物的过敏反应
• 3 结果与分析
• 3.1 不同浓度的HarpinEccs 诱导烟草的过敏反应
• 3.2 不同处理时间HarpinEccs 诱导烟草的过敏反应
• 3.3 HarpinEccs 诱导鸡冠花和玻璃海棠花的过敏反应
• 4 讨论
• 第三章 HarpinEccs 蛋白诱导烟草对烟草花叶病毒的抗性
• 1 材料
• 1.1 供试植物
• 1.2 供试病毒
• 1.3 供试药剂
• 2 方法
• 2.1 烟草花叶病毒有效接种量实验
• 2.2 HarpinEccs 防治烟草花叶病毒室内药效实验
• 3 结果与分析
• 3.1 烟草花叶病毒有效接种量的确定
• 3.2 HarpinEccs 防治烟草花叶病毒室内药效结果与分析
• 4 讨论
• 第四章 HarpinEccs 蛋白对烟草防卫反应相关酶活性的影响
• 1 材料、仪器与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 仪器
• 1.3 试剂
• 2 方法
• 2.1 材料处理
• 2.2 HarpinEccs 诱导烟草三种防卫反应相关酶活性的测定..
• 3 结果与分析
• 3.1 HarpinEccs 诱导烟草苯丙氨酸解氨酶活性的时序变化..
• 3.2 HarpinEccs 诱导烟草多酚氧化酶活性的时序变化
• 3.3 HarpinEccs 诱导烟草过氧化物酶活性的时序变化
• 4 讨论
• 第五章 HarpinEccs 蛋白诱导拟南芥基因表达图谱变化初步分析..
• 1 材料
• 1.1 供试植物及其培养
• 1.2 供试药剂
• 1.3 实验所用芯片
• 2 方法
• 2.1 材料处理
• 2.2 芯片分析取材
• 3 结果与分析
• 3.1 HarpinEccs 和HarpinEa 处理24h 诱导拟南芥基因表达差异比对分析
• 3.2 HarpinEccs 不同处理时间诱导拟南芥基因显著表达差异分析
• 3.3 HarpinEccs 不同处理时间诱导拟南芥木质素合成途径及相关基因表达情况分析
• 3.4 HarpinEccs 不同处理时间诱导拟南芥部分病程相关蛋白基因表达差异分析
• 4 讨论
• 4.1 HarpinEccs 和HarpinEa 处理24h 诱导拟南芥基因表达差异比对
• 4.2 HarpinEccs不同处理时间诱导拟南芥基因显著表达差异
• 4.3 HarpinEccs 不同处理时间诱导拟南芥木质素合成途径及相关基因表达情况
• 4.4 HarpinEccs 不同处理时间诱导拟南芥部分病程相关蛋白基因表达差异
• 第六章 结论
• 参考文献
• 附图
• 本文常见缩写符号
• 攻读硕士期间的科研成果
• 致谢